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Transcript

Escape RoomDa TranscriçãoInversa

Feito pelo Daniel Oliveira e Helena Camões (12ºB)

começar

Introdução

Na transcrição inversa é formada uma cadeia de DNA complementar (cDNA) a partir de RNA (mRNA). Para atingirmos o nosso objetivo final (obter cDNA) precisamos de:

Neste jogo, vamos percorrer as estapas necessárias para que ocorra a transcrição inversa. Este processo é útil no nosso projeto, pois, para amplificarmos certos genes, precisamos de DNA.

  • Provocar a lise celular (que fizemos na terceira semana);
  • Separar o RNA (que fizemos na quinta semana);
  • Lavar o RNA (que fizemos na sexta semana);
  • Dissolver o RNA (que fizemos na sexta semana);
  • Converter o RNA em cDNA (que fizemos na sexta semana).

+ info

1ª Etapa

2ª Etapa

3ª Etapa

4ª Etapa

5ª Etapa

6ª Etapa

Etapas

Para concluires o "escape room" tens de completar cada etapa!

1

Durante quanto tempo podemos guardar as placas depois desta etapa?

Apenas durante um dia (a -70ºC).

Durante um ano (a -70ºC) ou durante um dia (a 4ºC).

1ª Etapa

1ª Etapa

2ª Etapa

3ª Etapa

4ª Etapa

5ª Etapa

6ª Etapa

Etapas

Para concluires o "escape room" tens de completar cada etapa!

1

O que podemos concluir a partir da visualização deste vídeo?

As ribonucleases (RNAses) são muito fracas, logo uma enorme quantidade de RNAses não compromete os nossos resultados.

As ribonucleases (RNAses) são muito resistentes. Para além disso, uma quantidade muito reduzidade de RNAses no nosso ambiente de trabalho pode comprometer os nossos resultados.

2ª Etapa

Link do vídeo: https://youtu.be/x0OPUKTxanQ?si=HiWDSQrcQ6x2dm7t (consultado a 20/03/2024). Este vídeo demonstra o problema das RNAses e de que forma a sua presença compromete os nossos resultados.

1ª Etapa

2ª Etapa

3ª Etapa

4ª Etapa

5ª Etapa

6ª Etapa

Etapas

Para concluires o "escape room" , tens de completar cada etapa!

Sabendo que o isopropanol pertence à família dos alcoóis, que imagem corresponde à fórmula química do isopropanol?

1

3ª etapa

1

2

3

1ª Etapa

2ª Etapa

3ª Etapa

4ª Etapa

5ª Etapa

Sexta etapa

Etapas

Para concluires o "escape room", tens de completar cada etapa!

Por que razão centrifugamos as amostras nesta etapa?

1

Como o RNA é mais denso, ele irá ficar na parte superior do eppendorf, o que torna mais fácil a sua remoção.

Como o RNA é mais denso, ele irá ficar na parte inferior do eppendorf. Depois de descartarmos o sobrenadante e de deixarmos evaporar os restos de sobrenadante que possam existir, teremos a nossa amostra de RNA (que iremos utilizar na próxima etapa)

Test 6

1ª Etapa

2ª Etapa

3ª Etapa

4ª Etapa

5ª Etapa

6ª Etapa

Etapas

Para concluires o "escape room", tens de completar cada etapa!

1

Falso

Verdadeiro ✓

Presta atenção a esta imagem.Agora, indica se a afirmação seguinte é verdadeira ou falsa "Esta solução garante a pureza do RNA"

4ª etapa

1ª Etapa

2ª Etapa

3ª Etapa

4ª Etapa

5ª Etapa

6ª Etapa

Etapas

Para concluires o "escape room", tens de completar cada etapa!

1

continuar

Cada componente pertence a uma Mix. Arrasta o componente para o quadrado da Mix a que pertence.

Master Mix

Enzyme Mix

1.Primers

2.dNTPs

3.Reverse Transcriptase

Solución

4.MgCl2

5.RT buffer

SOLUção

6ª etapa

6.Inibidor de Ribonucluease

Parabéns

Terminaste o Escape Room! Agora é o expert da transcrição inversa!!

Queres começar de novo?

voltar

Essa resposta não está correta...

Mas não desanimes! Volta a tentar.

Oh oh!

Aqui está o link de um vídeo que explica de uma forma resumida o processo de formação do cDNA.https://youtu.be/rKPJpxCW2qw?si=znkV4W2VGvypAu2H (consultado em 20/03/2024)

Link da imagem

https://www.mercedesscientific.com/buy/product/depc-treated-water/CLENCe589e8c2555c5821fde6121f5375f1d5 (consultado a 22/03/2024)

Webgrafia das imagens

1: https://sielc.com/compound-1-3-propanediamine (consultado a 20/03/2024)2:https://www.fishersci.co.uk/shop/products/isopropanol-extra-pure-slr-fisher-chemical/11428782 (consultado a 20/03/2024)3:https://www.chemspider.com/Chemical-Structure.175.html (consultado a 20/03/2024)

Objetivo: o etanol promove a precipitação do RNA, enquanto os contaminantes permanecem em solução, logo garantimos que a nossa amostra de RNA não está contaminada

"Lavagem" do RNA

Protocolo:

  • Centirfugar os eppendorfs a 13000 rppm durante 15 minutos a 4ºC e retirar sobrenadante;
  • Misturar num falcon 35 ml de etanol e 15 ml de água;
  • Introduzir 400 μL da solução criada no passo anterior em cada eppendorf;
  • Centrifugar os eppendorfs durante 10 minutos a 10 000 rppm e 4ºC;
  • Descartar 400 μL de sobrenadante;
  • Deixar evaporar o restante do sobrenadante.

Objetivo: obter o RNA em solução aquosa. Após a centrifugação, a mistura do NZYol com o clorofórmio irá provocar a separação da solução em várias fases, nomeadamente:

  • A superior, que contém o RNA em solução aquosa;
  • A intermédia, que contém DNA e proteínas;
  • A inferior, que contém compostos orgânicos.

Protocolo:

  • Colocar o que se encontra em cada poço num eppendorf (os eppendorfs foram numerados, previamente, de 1 a 25);
  • Transferir 100 μL de NZYol para cada poço;
  • Transferir 80 μL de clorofórmio para cada poço;
  • Colocar os eppendorfs no vortex durante 15 segundos;
  • Colocar os eppendorfs no gelo durante 15 minutos;
  • Colocar os eppendorfs na centrifugadora durante 15 minutos;
  • Recolher 100 μL da parte superior (RNA em solução aquosa);
  • Colocar o que foi recolhido em novos tubos numerado de 1-25.

Separação

Nota

A RNAse AWAY é muito importante, pois evita a contaminação de RNA. Antes de seguir o protocolo, é necessário utilizar RNAse AWAY para limpar a superfície da hoste e todos os materiais que vamos utilizar. (Fotografia de Leonor Santos).

Nós podemos fazer esta etapa e a próxima (precipitação do RNA) no mesmo dia. Não é necessário qualquer tempo de espera.

Objetivo: precipitar o RNA (o isopropanol provoca a sua precipitação. Como o nosso objetivo final é converter RNA em cDNA, esta etapa é fundamental.

Precipitação do RNA

Protocolo:

  • Adicionar 150 μL de isopropanol a cada eppendorf;
  • Colocar as amostras a -20ºC durante 10 minutos;
  • Centrifugar a 12000g duarante 10 minutos a 4ºC
  • Descartar o sobrenadante com uma pipeta;

Master Mix

1245

Enzyme Mix

36

Objetivo deste passo:O NZYol provoca a lise e homogeneização das células, mas preserva o RNA que é essencial para a transcrição reversa.

Lise e homogeneização

Protocolo:

  • centrifugar as placas que têm estímulos (preparadas em sessões anteriores) na centrifugadora;
  • transferir 80 μL de cada dessas placas para outras placas com poços redondos;
  • colocar 100 μL de NZYol em cada poço das novas placas

Objetivo: garantir a pureza do RNA

Lavagem do RNA

Para garantirmos a pureza do RNA, nós utilizamos "DEPC-trated water" que é uma solução aquosa que inativa as enzimas RNAses.Assim, na próxima etapa (conversão de RNA em cDNA), iremos incluir "DEPC-treated water" .

Objetivo: tornar RNA em cDNA.

Protocolo:

  • Misturar num tubo de falcon 286 μL de Master Mix e 57,2 μL de Enzyme Mix;
  • Num eppendorf de maior capacidade,escrever na tampa "Mix";
  • No eppendorf "Mix" colocar a mistura do tubo de falcon e 8 μL de "DEPC-treated water"
  • Em cada tubo numerado de 1-24 introduzir 12 μL da mistura que estava no eppendorf "Mix";
  • Escrever "RNA" no tubo 25;
  • Introduzir 10 μL de Master Mix, 2 μL de "DEPC-treated water" no eppendorf "RNA";
  • Escrever "H2O" noutro eppendorf de 200 μL e adicionar 12 μL de "DEPC-treated water".
  • Colocar os 26 eppendorfs no termociclador e colocar no programa "Bio-RAD T100 Thermal Cycler".

Transcrição inversa

Fotografia do termociclador de Leonor Santos.

Configuração (protocolo do programa):

  • 25ºC durante 10 minutos;
  • 50 ºC durante 30 minutos;
  • 85ºC durante 5 minutos;
  • 4ºC eterno (durante tempo infinito)

  • Primers: segmentos de ácidos nucleicos necessários para a replicação do DNA;
  • Reverse Trancriptase: enzima necessária para a "transformação" do RNA em cDNA;
  • Inibidor de Ribonuclease: inibe a ação de ribonucleases, que são enzimas que catalisam (aceleram) a degradação do RNA.

  • dNTPs: desoxirribonucleotídeos trifosfato, nucleótidos de DNA formados por uma base azotada, um açúcar e 3 grupos fosfato (trifosfato);
  • MgCl2: estabiliza o cDNA e ativa a enzima Taq polimerase, que é responsável por sintetizar DNA com a ajuda de um primer a tempreaturas elevadas, a partir de cadeias simples;
  • RT buffer: Reverse Transcriptase buffer. Otimiza a ação da enzima Reverse Transcriptase

Esclarecimentos

Webgrafia:https://www.sciencedirect.com/topics/agricultural-and-biological-sciences/reverse-transcription (consultado a 23/03/2024)