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Transcript

Sergio Yagüe VarasCyTA

Diario de misión Analisis y Control de Calidad de los alimentos (ACC)

Reto 1 - Extracción en fase sólida (SPE)

Se trata de una técnica de preparación de muestras usada en laboratorios de analisis.Permitiendo la extracción, eliminación de interferencias y concentración de analitos de la muestra antes de ser cuantificados.Siendo ideal para la extracción de analitos en muestras líquidas o para la purificación de extractos líquidos

¿Qué es?

Introducción

Se elige una fase sólida con afinidad/selectividad al analito de interes:

  • Fases sólidas apolares: Siendo los más utilizados. Son usados para compuestos organicos presentes en disoluciones polares. Los más usados son el C8 y C18.
  • Fases sólidas polares: Utilizados en la purificación de extractos orgánicos. Ejemplos: sílice o alúmina.
  • Fases sólidas de intercambio iónico: Se usan en la eliminación de iones interferentes con carga opuesta a la del analito. Siendo utilizadas resinas de intercambio catiónico para retener cationes y liberar protones y resinas de intercambio aniónico para retener aniones y liberar grupos hidroxilo.
1. Selección de fase sólida

Fases

  • Paso para eliminar el solvente residual del paso anterior y equilibra el sorbente para maximizar la interacción con el analito.
3. Equilibrar
  • Lavando la columna con solventes de acondicionamiento adecuados, preparamos la fase sólida antes de aplicar la muestra, esto mejora la afinidad con el analito y elimina posibles impurezas.
2. Acondicionar

Fases

5. Lavado

Utilizando solventes de lavado, se eliminan interferencias que aún estén unidas al sorbente, sin arrastrar con ello al analito que se deasea analizar.

Cargando y pasando lentamente la muestra por el sorbente, lo que hace que el analito se adsorba selectivamente en la fase solida, mientras algunas interferencias pasaran a traves y otras aun podrían quedarse en el sorbente.

4. Carga de la muestra

Fases

Usando solventes de elución adecuados, se libera el analito de interés de la fase sólida dejando una muestra limpia de interferencias y lista para su analisis posterior.

6. Elución

Fases

  • Analito: Compuesto específico que se desea analizar
  • Interferencia: Toda sustancia que que perturba negativamente en la precisión y/o exactitud de la medición del analito de interés.
  • Fase sólida: Medio sólido utilizado para retener los analitos de interés.
  • Selectividad: Capacidad dela fase sólida para retener selectivamente los analitos de interés y eliminar la interferencia de la muestra.
  • Solvente: Sustancia líquida capaz de disolver otras sustancias formando una mezcla homogénea.
  • Solvente de condicionamiento: Solvente utilizado para preprar la fase sólida antes de cargar la muestra.
  • Solvente de lavado: Solvente utilizado para eliminar impurezas no deseadas de la fase sólida.
  • Solvente de elución: Solvente utilizado para recuperar los analitos de interes de la fase sólida.

Terminología

Aula virtual | Universidad Rey Juan Carlos. (s. f.). https://www.aulavirtual.urjc.es/moodle/pluginfile.php/12558962/mod_resource/content/1/ACC_Tema%203_Natalia_2023-2024.pdf

Solid Phase Extraction (SPE). (s. f.). https://www.sigmaaldrich.com/ES/es/applications/analytical-chemistry/sample-preparation/solid-phase-extraction

Extracción en fase sólida - Affinisep. (s. f.). Affinisep. https://www.affinisep.es/tecnologias/extraccion-en-fase-solida/#:~:text=La%20extracci%C3%B3n%20en%20fase%20s%C3%B3lida,analitos%20antes%20de%20su%20cuantificaci%C3%B3n.

Phenomenex. (2017, 19 septiembre). Un vistazo rápido a la extracción en fase sólida (SPE) [Vídeo]. YouTube. https://www.youtube.com/watch?v=XkUsztsVaNY

Admin. (2023, 5 enero). Food Safety and Solid Phase Extraction – An Essential Guide for Switching from a Manual to an Automated Protocol. Gilson. https://es.gilson.com/learninghub/post/food-safety-and-solid-phase-extraction-an-essential-guide-for-switching-from-a-manual-to-an-automated-protocol.html

Reto 2 - Artículo científico

Cita APA del artículo

Carmona Alvarado, I. F. (2006). Desarrollo y validación de un método de extracción en fase sólida para la determinación de plaguicidas catiónicos (cuats) en alimentos (Doctoral dissertation, Universidad Autónoma de Nuevo León).

El objetivo del articulo es informar sobre la acción, evaluación medioambiental, toxicidad y métodos analiticos para detección y cuantificación de los herbicidas Paracuat (PQ), Dicuat (DQ) y el Difenzocuat(DF); muy utilizados en la agricultura. Donde se utiliza la Extracción en Fase Sólida (SPE) como un método para preparar las muestras antes de sus análisis; extrayendo, limpiando y concentrando el analito de interés de las muestras de agua, suelo o productoas agrucolas.Tras la SPE, el artículo nos informa que las técnicas de análisis usadas son la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) con ultravioleta (UV) o la espectrometría de masas (MS).

Objetivo

Como de estos analitos los niveles de concentración son muy bajos y muy unidos a la matriz se necesita usar el método SPE.Como se dijo antes, este metodo consta de varias etapas:1- Acondicionamiento de fase estacionaria: en la columna se rellena con silica, resina, ...; y se acondiciona con metanol, agua, etc.2- Carga de la muestra3- Lavado: usando un disolvente adecuado (metanol, acetonitrilo, agua, etc) para eliminar los componentes de la matriz que pueden interferir4- Elución del analito: usando un disolvente adecuado (HCL, TFA, HFBA, ...) para desorber y recuperar el analito.Los materiales, reactivos y disolventes adecuados para cada etapa se eligen teniendo en cuenta las propiedades quimicas del analito y matriz de la muestra.Tambien se tienen en cuenta los factores que afectan la recuperación - Tipo de fase estacionaria- Volumen de muestra- Velocidad de flujo de la extracciónComposición del solvente de elución- Volumen del solvente de elución

Resumen - método SPE

La técnica de analisis empleada principalmente es la cromatografía líquida de alta resolucion acoplada a un detector de fluorescencia (HPLC - UV).HPLC: separa en una muestra líquida, obtenida tras la SPE, que se bombea a través de una columna con un material estacionario. Los componentes se separan en función de su interacción y se eluyen de la columna en diferentes tiempos, permitiendo su separación y cuantificación.Detector UV: es utilizado para aprevechar la capacidad de los compuestos que emiten luz fluorescente al ser excitados por la radiación UV. Pudiendo ser detectados y cuantificados con alta sensibilidad y selectividad en función de sus propiedades.Esta técnica conjunta permite una separación, identificación y cuantificación mejor de los compuestos PQ, DQ y DF, siendo fundamental para la evaluación de su presencia y concentración en las muestras.

Resumen - método de analisis

Strata Screen C
Oasis MCX

En las siguientes imagenes se muestran las condiciones optimas para el SPE, el cromatograma obtenido para una mezcla de estándares de cuats (20 ppm), bajo las condiciones óptimas de extracción en los cartuchos de Oasis MCX y STrata Screen C

Resultados

Reto 3 - Esquema

Reto 3 - Esquema

Reto 3 - Esquema

52,5µg/Kg
75µg/Kg x 0,7 =
1000g
X2
2g
0,15µg
X1
0,015 L
1L
10µg
10µg/L
10ng/mL
1. ¿Cuál es la concentración de antibiótico en la muestra de carne inicial expresada en µg/Kg y sabiendo que el porcentaje de recuperación de todo el proceso es del 70%?

Reto 3

Tipo de cartucho MAX de 200 mg, adsorbente en modo mixto de fase reversa e intercambio aniónico para ácidos, lo que nos dice que este cartucho tiene una fase sólida hidrófobica que dejará pasar el agua y compuestos polares y retiene compuestos orgánicos, y tiene una alta selectividad para compuestos ácidos.

2. ¿Qué tipo de cartucho de SPE se utiliza? ¿Qué propiedades tiene? ¿Cómo será su interacción con el analito? ¿Es selectivo? Justifica y razona las respuestas.

Reto 3

El ajuste de pH antes del SPE se realiza con intención de mejorar la eficiencia de la extracción aumentando la solubilidad del analito, aumentar la selectividad al cambiar la carga de los analitos y reducir las posibles interferencias al modificar las interacciones entre estas y los analitos.Se eluye con ácido formico a pH 2 para realizar la desorción selectiva de los analitos retenidos en el cartuchodebido a la competencia entre iones (H+) del acido y los iones de carga negativa de la columna.

3. ¿Por qué se ajusta el pH antes de la SPE? ¿Por qué se eluye a pH 2,0? Justifica y razona las respuestas.

Reto 3

Se añade hexano para que este se una a los compuestos lipídicos (grasas) que tiene la muestra pero que no fueron extraidos en la extracción hecha con acetonitrilo, y así eliminar interferencias. Se trata de una extracción líquido-líquido

4. ¿Por qué se adiciona hexano? ¿Qué tipo de extracción se está realizando en esta parte del protocolo? Justifica y razona las respuestas.

Reto 3

Sí, se realizan 3 preconcentraciones siendo la primera en la extracción de acetonitrilo, la segunda en la extracción con hexano y la última en la extracción en fase sólida. Esto se debe a que trás pasar por estas extracciones se aumenta la sensibilidad del método, aumentan la concentración de analitos y reducen las interferencias.

5. ¿Se produce preconcentración en alguna etapa del proceso? Justifica y razona las respuestas.

Reto 3

Se adiciona el OPA para derivatizar la muestra problema y conseguir compuestos fluorescentes que mejoran la detección y cuantificación de estos compuestos en el cromatógrafo acoplado a detecter de fluorescencía

6. ¿Por qué se adiciona orto-ftaldialdehido (OPA) a la muestra antes de inyectarla en el cromatógrafo? ¿Qué función tiene este compuesto? Justifica y razona las respuestas.

Reto 3

Se a empleado un detector de fluorescencia siendo el más adecuado, tras usar el OPA, por su gran sensiblidad y especificidad de señal.Se podría usar un detector de UV-Vis, si no se añade el OPA antes, pero otros compuestos podrían interferir ya que este tiene una sensibilidad y selectividad inferior.

7. ¿Qué tipo de detector se emplea en este método? ¿Es adecuado para el tipo de analitos? ¿Qué otro detector podría emplearse para la detección y cuantificación de los compuestos? Justifica y razona las respuestas.

Reto 3

Se trata de una separación de analito en fase reversa, ya que se quiere aislar analitos apolares , además de el uso de un cartucho MAX usado en fase reversa.El modo cromatografico es el adecuado dado que nos da un cromatografo muy sensible y selectivo.

8. Según las condiciones cromatográficas, ¿la separación del analito se lleva a cabo en fase reversa o en fase normal? ¿Crees que el modo cromatográfico empleado es el adecuado? Justifica y razona las respuestas.

Reto 3