TD : la réplication de l'ADN

Objectif : découvrir comment se fait la réplication (phase S), c’est-à-dire la fabrication de la 2ème chromatide grâce à un TD « dont vous êtes le héros ».

Etape 1 : les hypothèses

Schématisez les différentes hypothèses, en utilisant le bleu pour les chaines de nucléotides initiales et le rouge pour les chaines de nucléotides nouvellement créées.

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Tu as trouvé 3 hypothèses?

Tu as trouvé 2 hypothèses?

Tu as trouvé 1 hypothèse ?

Tu as trouvé 3 hypothèses?

Tu as trouvé 2 hypothèses?

Tu as trouvé 1 hypothèse ?

Etape 2 : le nom des 3 hypothèses

Les trois modèles hypothétiques de réplication s’appellent : - réplication conservative - réplication semi-conservative - réplication dispersive

Sachant que les termes de "conservative", "semi-conservative" et "dispersive" font référence à la molécule d’ADN initiale, complétez vos schémas de l’étape 1.

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Etape 8 : Aïe, votre interprétation des résultats est erronée…

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Etape 9 : Aïe, votre interprétation des résultats est erronée…

Etape 3 : expérimenter pour trancher entre les différentes hypothèses.

Pour trouver quelle hypothèse était la bonne, James Taylor puis Meselson et Stahl cultivent des bactéries E. Coli dont l'avantage est de présenter des cycles cellulaires rapides (moins de 30 min) et synchronisés. Ces bactéries sont cultivées sur un milieu normal*. Après extraction de leur ADN, on pratique une centrifugation de ces molécules, dite en gradient de densité**. On agit de même avec des bactéries cultivées sur un milieu dont l'azote normal 14N est remplacé par l'isotope 15N de l'azote, dit azote lourd.

Résultats témoins obtenus :

Expérience : Des bactéries E. coli sont cultivées dans un milieu ne contenant que de l’azote 15N pendant 14 cycles cellulaires. On considère alors que leur ADN ne contient que de l’azote 15N. On les remet ensuite en culture dans un milieu ne contenant que de l’azote 14N.

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Représenter les résultats attendus pour chacune des hypothèses à l’issue de ce 1er cycle cellulaire. Vous choisirez 2 couleurs différentes : - le bleu pour les chaines de nucléotides riches en 15N - le rouge autre pour les chaines de nucléotides riches en 14N

Besoin d'aide? Représenter les tubes qui devraient être obtenus après centrifugation. Préciser les proportions de chaque « type » d’ADN : - ADN ne contenant que de l’azote 15N, s’il y en a - ADN ne contenant que de l’azote 14N, s’il y en a - ADN contenant à la fois de l’azote 14N et de l’azote 15N, s’il y en a

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Encore un peu d'aide ?

Étape 7 : Bonne interprétation ! Mais il reste encore 2 hypothèses…

Expérience suivante : Les bactéries E. coli sont maintenues pendant une génération supplémentaire dans un milieu contenant de l’azote 14N.

Représenter, pour chacune des 2 hypothèses restantes, les molécules d’ADN obtenues, ainsi que les résultats de l’ultra-centrifugation, après ce cycle supplémentaire.Avec le même code couleur : bleu avec nucléotides 15N, rouge avec nucléotides 14N.

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Etape 4 : Représenter les résultats attendus

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⇒ Si la réplication se fait selon le mode conservatif: comment va être la molécule d’ADN néo-synthétisée? Combien de bandes va-t-on voir dans le tube? Quelles en seront les densités?

⇒ Si la réplication se fait selon le mode semi-conservatif: comment va être la molécule d’ADN néo-synthétisée? Combien de bandes va-t-on voir dans le tube? Quelles en seront les densités?

⇒ Si la réplication se fait selon le mode dispersif: comment va être la molécule d’ADN néo-synthétisée? Combien de bandes va-t-on voir dans le tube? Quelles en seront les densités?

Etape 5 : Résultats obtenus

Comparez ce résultat avec les résultats attendus. Une des hypothèses est réfutée. Précisez laquelle, en justifiant votre réponse.

l’hypothèse conservative est réfutée l’hypothèse semi-conservative est réfutée l’hypothèse dispersive est réfutée Je ne vois pas comment faire

Reprenez les schémas de l’étape 1 :

Etape 6 : Besoin d'aide?

Clique pour t'aider à donner la densité de chacune des molécules d’ADN obtenue selon l'hypothèse? Prêt pour comparer aux résultats obtenus ?

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Si les 2 chaines sont constituées d’15N (ADN 15N/15N), alors sur le schéma, les 2 chaines de nucléotides sont bleues, la molécule sera « lourde », c’est-à-dire au même endroit que le témoin ADN 15N

Si les 2 chaines sont constituées d’14N (ADN 14N/14N), alors sur le schéma, les 2 chaines de nucléotides sont rouges, la molécule sera « lourde », c’est-à-dire au même endroit que le témoin ADN 14N;

Si une des chaines est constituée d’14N et l’autre d’15N (ADN 14N/15N) , alors, sur le schéma, une des chaines est bleue, l’autre est rouge, la densité de la molécule sera intermédiaire.

Etape 5 : Résultats obtenus

Comparez ce résultat avec les résultats attendus. Une des hypothèses est réfutée. Précisez laquelle, en justifiant votre réponse.

l’hypothèse conservative est réfutée l’hypothèse semi-conservative est réfutée l’hypothèse dispersive est réfutée

Résultat de l’ultracentrifugation après 2 générations en milieu 14N :

Etape 10 : Résultats obtenus à la deuxième génération

Quelle hypothèse est donc verfiée ?

La réplication est semi-conservative !

La réplication est dispersive !

BRAVO !

* L'azote est un constituant majeur de l'ADN. L'azote14 (14N) en est, de loin, l'isotope le plus répandu sur Terre, contrairement à l'azote 15 (15N) considéré comme lourd. Ce dernier n'est pas radioactif, juste plus lourd que l'isotope commun, car il contient un neutron supplémentaire.

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** Gradient de densité : on prépare des tubes dont la densité varie en fonction de la position dans le tube. Lorsque de l'ADN est extrait des cellules puis centrifugé sur un gradient salin de densité, l'ADN migre jusqu'au point où sa densité est égale à celle de la solution saline.