proteinas

PROTEINAS

PROTEINAS

¿Cómo pueden purificarse las proteínas?

Una preparación pura de proteínas es esencial para poder determinar sus propiedades y su actividad, pues cada célula puede tener miles de tipos de proteínas

Los métodos clásicos de separación de proteínas aprovechan propiedades que varían de una proteína a otra, incluyendo propiedades, carga y tamaño. A estos métodos se le han añadido recientemente otros como lo es el clonaje del DNA

La fuente de proteínas son generalmente células microbianas. Para poder purificar una proteína es necesaria la ruptura de estas células y así poder liberar estas proteínas en una solución conocida como extracto en crudo

Una vez obtenido el extracto, se disponen de diversos métodos para purificar las proteínas que estos contienen, este extracto se somete a tratamientos que separa las proteínas en diferentes fracciones en base a algunas propiedades como su tamaño, a este paso de la conoce como fraccionamiento.

Uno de liso primeros pasos del fraccionamiento utiliza la diferencia de solubilidad de las proteínas que es una función compleja del pH, la temperatura, concentración de sal, etc. La solubilidad de ciertas proteínas disminuye en presencia de ciertas sales, es un efecto denominado “salting out”. La adición de ciertas sales puede precipitar selectivamente ciertas proteínas, permaneciendo las otras en solución.

Las proteínas de interés pasan por procesos de purificación. La diálisis, por ejemplo, es un procesos que separa las proteínas de los solutos pequeños aprovechando el mayor tamaño de las proteínas

¿Cómo pueden purificarse las proteínas?

Los métodos más potentes para el fraccionamiento de las proteínas utilizan la cromatografía de columna, que aprovecha la diferencia de cargas, tamaños y demás propiedades de las proteínas. La fase estacionaria se introduce en una columna y una disolución tamponada (fase móvil) pasa a su través

La cromatografía de intercambio iónico aprovechas las diferencias en el signo y la magnitud de las cargas eléctricas netas de las proteínas a un pH determinado. La matriz de la columna es una resina que tiene unidos grupos cargados; los que tienen unidos grupos anicónicos se llaman intercambiadores catiónicos y los que tiene un grupo catiónico se llaman intercambiadores anicónicos

¿Cómo pueden purificarse las proteínas?

Gracias a la afinidad de cada proteína por los grupos cargados está afectada por el pH y las concentraciones de iones salinos libres.

¿Cómo pueden purificarse las proteínas?

En la cromatografía de intercambio catiónico, a matriz solida tiene grupos cargados negativamente, en la fase móvil las proteínas con carga neta positiva migran a través de la matriz más lentamente que las que tienen carga negativas. Obtenidas las fracciones se pueden analizar para averiguar la presencia de la proteína de interés o conocer cierta propiedad.

La cromatografía de excusión molecular también conocida también como de filtración en gel, separa proteínas en base a su tamaño. En este método, las proteínas de mayor tamaño emergen de las columnas antes que las pequeñas, un resultado que parece extraño a primera vista. La fase solida consiste en unas pequeñas perlas hagas de material entrecruzados. Las proteínas grandes al no poder entrar en las cavidades, toman un camino más corto, rodeando las partículas por el exterior mientras que las pequeñas penetran las cavidades y son más tardadas.

La cromatografía por afinidad se basa en la afinidad de unión de proteínas. Las partículas de la columna tienen en este caso un grupo químico unido covalentemente llamado ligando, una molécula que se une a una macromolécula, en este caso una proteína, cuando se carga una mezcla de proteínas cualquiera que tenga afinidad por este ligando se unirá a la molécula de resina, retardando la función biológica de la proteína a través de la columna.

¿Cómo pueden purificarse las proteínas?

Los métodos cromatográfIcos pueden incrementar su rendimiento gracias al uso de HPLC (HighPerformance Liquid Chromatography, es una técnica utilizada para separar los componentes de una mezcla.) La HPLC usa bombas de alta presión que acelere el movimiento de las moléculas de proteínas a trabe de la de la columna. Al disminuir el tiempo de tránsito en la columna, la HPLC puede limitar la expansión de las bandas de proteínas por difusión y así mejorar la resolución.

LAS PROTEINAS PUEDE SEPARARSE Y CARACTERIZARSE POR ELECTROLISIS.

Otra importante técnica para la separación de proteínas se basa en el desplazamiento de las proteínas cargadas en un campo eléctrico, proceso denominado electroforesis. Estos procedimientos no son utilizados generalmente para purificar proteínas en grandes cantidades dado que existen usualmente métodos alternativos más sencillos y que los métodos electroforéticos suele afectar negativamente a la estructural y por tanto a la función de las proteínas.

No obstante la electroforesis es sumamente importante como método analítico, su ventaja es que las proteínas pueden visualizarse además de separarse, lo que permite al investigador hacer una estimación rápida del número de proteínas

¿Cómo pueden purificarse las proteínas?