TP_biomol_Portéines_SV_D

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Stéphanie Dalaine

en conditions dénaturantes Analyse de documentsUtilisation d'un logiciel de représentation moléculaire PyMol

TP Biologie moléculaireEtude de protéines en conditions dénaturantes

vous pouvez à tout moment revenir sur l'index en cliquant sur l'icône "maison"

Auto-évaluation

Ex4- TNF/NFKB

Ex3- cellules nerveuses

Ex2- Ribonucléotides réductase

Ex1- Urines chiens

Vidéo-Western Blot

SDS: détergent

à retenir sur SDS-PAGE

rappels sur les protéines

Vidéo: SDS-PAGE

Index

Exbonus: électrophorèse native des protéines sériques de différentes espèces

Stéphanie Dalaine

SDS-PAGE en VIDEO

On retient les grandes étapes de l'électrophorèse en conditions dénaturantes et son application.

Vidéo

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• de la séquence ordonnée de ses acides aminés
• des hélices alpha, feuillets bêta, coude et boucles déterminés par les atomes de la liaison peptidique
• des interactions de faible énergie (liaisons H, électrostatiques, forces de VdW) déterminées par les caractéristiques des résidus (apolaire, polaire chargé, polaire non chargé)
• des liaisons covalents de type ponts disulfures

• du pH
• de la température

La conformation "native" et donc fonctionnelle de la protéine dépend

Rappels cours de SV-D-2-4 Acides aminés et protéines

Stéphanie Dalaine

Rappels sur les travaux d'Anfinsen sur la ribonucléase cf SV-D-2-4

Les liaisons faibles interviennent en priorité dans l’établissement de la conformation moléculaire, avant les ponts disulfures

Cf SV-D-2-4 Acides aminés et protéines

Stéphanie Dalaine

Séparation de protéines par électrophorèse en conditions dénaturantes

SDS – PAGE = Sodium Dodécyl Sulfate PolyAcrylamide Gel Electrophoresis = Electrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS La dénaturation est une transformation d'une protéine qui lui fait perdre sa structure tridimensionnelle initiale. La dénaturation consiste en un chauffage en présence de SDS (Sodium Dodecyl Sulfate), un puissant détergent, et de βmercaptoéthanol, permettant de rompre les ponts disulfures.

Le SDS interagit très fortement avec l'ensemble des acides aminés apolaires en formant avec eux des liaisons de Van der Waals qui permettent de déplier totalement la protéine et de la rendre intégralement linéaire et chargée négativement (le SDS étant lui-même chargé négativement). Ainsi, toutes les protéines migreront vers la même électrode l'anode (chargée +) et elles seront séparées uniquement selon leur masse, ce que ne permet pas l'électrophorèse en conditions natives.

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La présence d'un détergent fait qu'il est impossible (pour des raisons de tension superficielles) de faire un dépôt précis de protéines sur un gel d'acétate de cellulose. L'électrophorèse en conditions dénaturantes se fait donc uniquement sur gel de polyacrylamide, dont nous ne disposons pas au lycée. On parlera alors de SDS-PAGE, un terme à connaître absolument.

Le SDS un puissant détérgent

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Suite à un SDS-PAGE, on peut réaliser un Western Blot

Aprè un SDS-PAGE, il est possible de transférer les protéines sur une membrane et de les révéler par des Ac marqués.

Vidéo

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Que signifie "conditions dénaturantes"

Stéphanie Dalaine

Réalisez les exercices dans l'ordre chronologique. la correction est proposée dans ce Genially.

N'hésitez pas à noter vos questions et à les poser lors de la prochaine séance.

Vous allez travailler en autonomie

Ex1: Un test d'analyse d'urines chez le chien

Filtration protéique au niveau du glomérule et du tubule

Test analyse d'urine

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1- Placer sur la figure la zone de dépôt et le sens de migration des protéines étudiées.

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Vous avez pensé à citer le marqueur de tailles comme référence pour identifier les masses moléculaires des protéines filtrées; vous avez comparé chaque échantillon au témoin.

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Retrouvez les étapes aboutissant à l'obtention d'un sérum.

Stéphanie Dalaine

ExBonus: Analyse de sérums de différentes espèces

Figure 1 : Séparation électrophorétique des protéines de sérums différents (coloration au bleu de Coomassie) en condition native1 : canard ; 2 : chèvre ; 3 : poule ; 4 : cobaye ; 5 : lapin ; 6 : singe ; 7 : chien ; 8 : cheval ; 9 : pigeon ; 10 : homme

densité de coloration de la bande d’électrophorèse.=> « pics » d’absorption, correspondant à une concentration importante d’un type de protéines ayant migré à cet endroit

analyse densitométrique

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électrophorèse des protéines sériques en conditions natives sur membrane d'acétate de cellulose (révélation rouge Ponceau)

analyse densitométrique de l'électrophorèse de B

analyse densitométrique de l'électrophorèse de A

Les deux EPS (électrophorèses de protéines sériques) de lapin présentent 4 types de protéines : l'albumine (luminance à 80%), les alpha-globulines puis les bêta-globulines et enfin les gamma-gobulines. Le lapin A de révèle une densitométrie de ses gamma légèrement supérieure au lapin B.

Stéphanie Dalaine

Comparaison densitométrique des deux EPS

Electrophorèse des Protéines Sériques : effectuée à partir d'une prise de sang, après centrifugation et qui permet le diagnostic et le suivi de nombreuses maladies comme une immunoglobuline monoclonale, une hypergammaglobulinémie et plus rarement une hypogammaglobulinémie voire une hypoalbuminémie.

EPS

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Comparer les résultats d’analyse densitométrique des sérums de mammifères par rapport à ceux des oiseaux.

EX2 : RIBONUCLEOTIDES REDUCTASE

1. Indiquer sur le schéma le sens de migration des protéines dénaturées. 2. Compléter le tableau suivant

Utilisation du papier semilog ou d'un tableur.

Autoradiographie après séparation par SDS-PAGE

Stéphanie Dalaine

1. Vous avez réussi à utiliser le papier semi-log (axes tracés, nommés avec les unités; graphie titré).Vous lisez sur le papier semi-log ou sur Excel : une masse moléculaire de 58 kDa pour la Cycline B et une masse de 47 kDa pour la ribonucléotides réductase.2. La masse moléculaire apparente est plus élevée que la masse moléculaire attendue sur des critères génétiques. La cycline B a donc subi de nombreuses modifications post-traductionnelles. On peut imaginer qu’elle est fortement glycosylée et/ou qu’elle a été phosphorylée en de nombreux sites.

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EX3 : ETUDE DU DEVELOPPEMENT DES CELLULES NERVEUSES DE MAMMIFERES

Stéphanie Dalaine

Il est important de comprendre l'information apportée lorsqu'on compare une électrophorèse en conditions natives vs dénaturantes.

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Le document 2 est une expérience de retard sur gel qui peut se pratiquer entre deux protéines ou entre une protéine et un fragment d’acides nucléiques. Il permet de montrer l’existence d’une interaction entre deux molécules (donc se pratique toujours en conditions non dénaturantes !).

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Prenez le temps de lire le contexte, le matériel et la méthode.

Immunodétection sur membrane après séparation par SDS-PAGE

EX4 : ACTION DE TNF SUR NFKB

Stéphanie Dalaine

On peut conclure de ces résultats qu’au cours du traitement des cellules par le TNF, IkB est phosphorylé par IKK puis cette forme phosphorylée P-IkB est rapidement dégradée.

Les fibroblastes mutants mIKK ne possèdent pas d’IKK fonctionnelle. Le contrôle au temps 0 est identique aux cellules sauvages. Toutefois après 5’ d’exposition on observe une faible phosphorylation d’IkB en P-IkB cohérente avec une très faible activité d’IKK. Après 10’ d’exposition au TNF, il n’y a plus de P-IkB dans la cellule tandis qu’il reste encore la moitié d’IkB par rapport à la quantité de départ. Ces derniers résultats confirment la disparition de P-IkB quelques minutes après sa formation.

En absence de TNF (t0) on constate qu’IkB est majoritairement sous forme non phosphorylé : bande forte pour IkB et très faible pour P-IkB. Après 5’ d’incubation en présence de TNF, on observe une très nette augmentation de la quantité d’IkB phosphorylée, corrélée avec une forte diminution d’IkB non phosphorylé. On peut en déduire que l’exposition au TNF provoque l’activation de l’enzyme IKK qui, par son activité kinase, phosphoryle IkB en P-IkB. Après 10’ d’exposition au TNF, il n’y a plus d’IkB dans les cellules, qu’il soit phosphorylé ou non. On peut supposer qu’IKK phosphoryle l’intégralité des molécules IkB en P-IkB et que cette dernière est ensuite rapidement dégradée.

D’après JM Fourneau, S. Guellec, 2014

Correction

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EX4 : ACTION DE TNF SUR NFKB

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On a vu précédemment qu’IkB était phosphorylée par IKK sous l’action du TNF puis était rapidement dégradée. Or NFkB est associée dans le cytosol à IkB, on peut donc proposer le déroulement suivant : a. Le TNF active l’enzyme IKK b. IKK phosphoryle IkB liée au NFkB dans le cytosol c. P-IkB est rapidement dégradé laissant libre NFkB d. NFkB n’étant plus inhibé par IkB migre dans le noyau des cellules où il exercera son rôle de facteur de transcription.

A partir des résultats précédents on peut en déduire qu’en absence de TNF, la protéine NFkB est majoritairement localisée dans le cytosol des cellules. L’exposition au TNF provoque la translocation de NFkB depuis le cytosol vers le noyau des cellules.

La quantité de NFkB totale dans la cellule ne varie pas au cours de l’expérience. A l’inverse, on remarque qu’au cours du traitement par le TNF, la quantité de NFkB nucléaire augmente progressivement. Après 1h d’exposition, quasiment l’intégralité de NFkB est localisée dans le noyau.

D’après JM Fourneau, S. Guellec, 2014

Correction

EX6 : ETUDE DU RECEPTEUR NICOTINIQUE A L'ACETYLCHOLINE

Stéphanie Dalaine

Analyse également possible sur LibMol

On mesure une distance Cys190-Trp 147 de 17,3 Angström, soit 1,73 nm lorsque le récepteur est occupé par la conotoxine. On en déduit que la conotoxine est un antagoniste à l'Ach.

Step 03

Step 02

On mesure une distance Cys190-Trp 147 de 10 Angström, soit 1 nm lorsque le récepteur est occupé par l'épibatidine. On en déduit que l'épibatidine est un agoniste à l'Ach.

Step 01

Après analyse via PyMol

Bravo, vous avez courageusement suivi ce TP de Biomol

Afin de vérifier vos nouvelles compétences vétérinaires, Testez-vous en réalisant la courte évaluation ci-après.

Allez courage, c'est bientôt terminé!

Stéphanie Dalaine

Cas clinique: EPS du chat Rymarien

Stéphanie Dalaine

Validation d'acquis

Identifier les protéines sériques.

Mettre dans l'ordre des différentes étapes de traitement de ce cas clinique.

EPS

le suivi du patient

Stéphanie Dalaine

c- une albuminémie normale

a- une hyperalbuminémie

b- une hypoalbuminémie

L'EPS de Rymarien révèle:

Analyse de l' EPS du chat Rymarien

Stéphanie Dalaine

c- un taux élevé de gamma-globulines

a- un taux élevé de bêta-globulines

b- un faible taux de bêta-globulines

L'EPS de Rymarien révèle:

En effet, l'aire sous la courbe du pic d'albumine est plus faible que celle de référence

Stéphanie Dalaine

Ach Schade!

Sorry....

Stéphanie Dalaine

Ach Schade!

Sorry....

Stéphanie Dalaine

La péritonite Infectieuse Féline (PIF) est une infection liée au coronavirus félin (FCoV). Le tableau clinique de la PIF est très variable. Néanmoins, dans la plupart des formes de la PIF, on observe une hypoalbuminémie associée à une hypergammaglobulinémie.Ainsi, l'augmentation de la globulinémie en raison de la forte hypoalbuminémie, rend son utilisation comme outil diagnostique peu fiable.

Le taux d'albumine (albuminémie) est la référence en EPS pour identifier des excès ou déficits en globulines.

Il faut sauver le chat de Vanessa Rymarien.

Bilan

Stéphanie Dalaine

Vous êtes désormais prêt.e.s à réaliser votre première EPS! Vive le sport!

Eureka!

Thanks!

Stéphanie Dalaine

Les anomalies rénales canines se manifestent régulièrement par une seule anomalie, le protéinurie (c’est-à-dire la filtration anormale de protéines par le rein).L’anomalie rénale touche soit le glomérule rénal, qui laisse alors passer dans l’urine des protéines supérieures à 60 kDa, soit le tubule, laissant cette fois passer de petites protéines inférieures à 40 kDa. Parfois, l’atteinte rénale est mixte, à la fois tubulaire mais aussi glomérulaire.Un nouveau test des urines de chien permet de réaliser une électrophorèse à partir d’urine récoltée sur du papier absorbant, ce qui peut faciliter la récolte d’échantillon pour le propriétaire.

1 : poids moléculaires connus : IgG = Immunoglobuline G, 150 kDa ; ALB = albumine, 66 kDa ; TPI = Triose Phosphate Isomérase, 27 kDa ; LZM = Lysozyme 15 kDa2 : Témoin négatif ;3 à 8 : Echantillons analysés chez des chiens différents (sauf 7 et 8 du même chien) ;7 : artefact dû à la présence d’un trop grand nombre de protéines dans l’échantillon 88 : échantillon 7 dilué au ½

Figure : Electrophorèse SDS-PAGE (électrophorèse sur gel polyacrylamide suite à application de Sodium Dodecyl Sulfate détergent se fixant tous les 2 résidus et ajoutant une charge fortement négative).

1 : poids moléculaires connus : IgG = Immunoglobuline G, 150 kDa ; ALB = albumine, 66 kDa ; TPI = Triose Phosphate Isomérase, 27 kDa ; LZM = Lysozyme 15 kDa2 : Témoin négatif ;3 à 8 : Echantillons analysés chez des chiens différents (sauf 7 et 8 du même chien) ;7 : artefact dû à la présence d’un trop grand nombre de protéines dans l’échantillon 88 : échantillon 7 dilué au ½

Figure : Electrophorèse SDS-PAGE (électrophorèse sur gel polyacrylamide suite à application de Sodium Dodecyl Sulfate détergent se fixant tous les 2 résidus et ajoutant une charge fortement négative).

Analyse

Chien 3 : légère protéinurie (albuminurie uniquement) liée à une atteinte glomérulaire ; Chien 4 : protéinurie liée à une atteinte glomérulaire plus sévère ; Chien 5 : protéinurie liée à une atteinte tubulaire ; Chiens 6 et 7-8 : protéinurie mixte