Klonierung

Klonierung

Einführung

„Blue Genes“-Koffer

Gentechnik in der Schule

Der „Blue Genes“-Koffer (BG-Koffer) war ein Experimentierkasten, der von der Firma Roche für den Einsatz im Schulunterricht konzipiert wurde und mittlerweile in abgewandelter Form von Promega angeboten wird. Er ermöglicht sowohl die Analyse von DNA als auch eine einfache Klonierung. Hierbei wird ein Restriktionsverdau, eine Ligation, eine Transformation und eine Selektion durchgeführt.

Alle dafür notwendigen Utensilien befinden sich im „Blue Genes“ -Koffer. In diesem Versuch wird das Experiment des „Blue Genes“-Koffers nachgearbeitet.

Einheiten

Mit jeder abgeschlossenen Einheit wird eine neue freigeschaltet.

3. Plasmidisolation

2. Plasmide

5. Ergebnisse

Einführung

4. Kerncurriculum

1. Medium vorbereiten

1. Medium vorbereiten

Für die Anzucht von Bakterien findet im Labor häufig das sogenannte LB-Medium Anwendung. Dies kann sowohl in flüssiger Form für die Anzucht von Flüssigkulturen verwendet werden, als auch durch Zugabe von Agar-Agar als Festmedium für das Ausplattieren und die Anzucht von Bakterienkolonien.

Herstellung LB-Medium (1 L):

• 8 g LB-Mischung in ca. 100 ml H₂O (Wasser vorlegen, Substanzen dann zugeben) vollständig lösen
• Auffüllen auf ca. 350 ml mit H₂O
• Einstellen des pH-Werts auf 7.0 mit 1 M NaOH (Schutzbrille und Handschuhe!)
• Volumen auf 400 ml mit H₂O auffüllen
• Autoklavieren

Medium vorbereiten

Methode

Wenn keine fertige LB-Mischung zur Verfügung steht können auch die Komponenten einzeln abgewogen und nacheinander gelöst werden:

10 g Trypton

5 g Hefeextrakt

5 g NaCl

Normalerweise sollte sich der pH-Wert schon bei 7 befinden, womit dieser Schritt auch entfallen kann

Falls kein Autoklav zur Verfügung steht, kann auch ein Dampfkochtopf oder eine Mikrowelle verwendet werden.

• Nach dem Autoklavieren Medien abkühlen lassen, bis die Flaschen „anfassbar“ sind. Achtung: Agar darf nicht fest werden!
• Vor dem Gießen sterile Zugabe der entsprechenden Zusätze, und erneut aufrühren, damit der Agar und die Zusätze gleichmäßig im Medium verteilt vorliegt
• Gießen von ca. 25 ml Medium pro kleiner Agarplatte (9 cm ∅) und abkühlen lassen.
• Platten bei 4 °C lagern.

Agarplaten gießen

Medium vorbereiten

Methode

am besten in einem Wasserbad, dabei unbedingt rühren

wenn benötigt, z. B. Antibiotika

Was ist besonders wichtig zu beachten bei der Einstellung des pH-Werts eines LB-Mediums?

Bei der Herstellung des LB-Mediums ist welche Vorgehensweise richtig?

Was ist beim Autoklavieren zu beachten, wenn das Festmedium direkt im Anschluss ausgegossen werden soll ?

Einheiten

3. Plasmidisolation

1. Medium vorbereiten

5. Ergebnisse

Einführung

4. Kerncurriculum

2. Plasmide

1922

Erste erfolgreiche Behandlung eines Menschen (Leonard Thompson) mit Insulin

1979

Entwicklung eines gentechnischen Verfahrens zur Insulinherstellung mittels E. coli-Bakterien

1985

Insulinpens kommen auf den Markt.

1916

Erstmals Gewinnung von Insulin aus Bauchspeicheldrüsen und Behandlung eines diabetischen Hundes.

1976

Verfahren zur Herstellung von synthetischem Humaninsulin entwickelt.

1983

Humaninsulin kommt auf den Markt.

1996

Schnell wirksame Analoginsuline

Insulinherstellung

GESCHICHTE DER

1865

Entdeckung von insulinproduzierenden Zellen

Obwohl die Symptome des Diabetes seit der Antike bekannt waren, stellte der Typ-1-Diabetes (der damals noch nicht so genannt wurde) noch vor hundert Jahren eine tödlich verlaufende Krankheit dar, denn es gab kaum Behandlungsmöglichkeiten. Durch stark kohlenhydratreduzierte Ernährung konnten die Erkrankten ein oder zwei Jahre überleben, bevor sie dann abgemagert ins diabetische Koma fielen und verstarben.

1860 wurde ein Diabetiker erstmals mit einem Extrakt aus den Bauchspeicheldrüsen von Kälbern behandelt, kurz darauf beschrieb Paul Langerhans, ein deutscher Pathologe, 1869 die sogenannten Inselzellen in der Bauchspeicheldrüse als Ort der Insulinproduktion.

Insulin aus Bauchspeicheldrüsen zu gewinnen gelang 1916 erstmals Nicolae Paulescu. Er setzte es bei einem diabetischen Hund erfolgreich ein und ließ sich dieses Herstellungsverfahren patentieren.

Die bekanntesten Personen, die man im Zusammenhang mit der Entwicklung des Insulins kennt, sind Frederick G. Banting und Charles H. Best. Sie extrahierten ebenfalls Insulin aus tierischen Fetten und nannten es Isletin. Mit Unterstützung des Biochemikers James Collip gelang es ihnen ein wesentlich reineres Extrakt zu gewinnen, mit dem im Jahr 1922 erstmals ein Mensch behandelt wurde.

Leonard Thompson überlebte 14 Jahre lang, bevor er an den Folgen einer Lungenentzündung starb. Der 5 Jahre alte Theodore Ryder wurde ebenfalls 1922 mit diesem Extrakt behandelt und wurde 75 Jahre alt.

Die erste Firma, die das patentierte Verfahren zur Gewinnung von Insulin nutzte, war Eli Lilly and Company. Viele Jahrzehnte lang wurde Insulin nun aus den Bauchspeicheldrüsen von Rindern und Schweinen aus Schlachtbetrieben gewonnen. Allerdings benötigte man eine sehr große Anzahl an Tieren. Für 100 kg Insulin waren 7,5 Millionen Tiere notwendig. Auch waren immunologische Nebenwirkungen nicht selten.

Um dieses Problem in den Griff zu bekommen, musste ein anderes Herstellungsverfahren gefunden werden. Dies gelang 1976 zwei Chemikern der Firma Hoechst. Sie synthetisierten Humaninsulin aus Schweineinsulin, da es nur einen Unterschied in der Eiweißstruktur bei beiden Insulinen gibt.

Die gentechnische Herstellung von Insulin gelang erstmals 1979 bei Genentech. Hierzu wurden entsprechende Gene in E. coli-Bakterien eingeschleust. Dadurch war es nun möglich, Insulin in großen Mengen herzustellen, um den inzwischen steigenden Bedarf zu bedienen.

Hoechst bringt 1983 das aus Schweineinsulin synthetisierte Humanisulin auf den Markt.

Der erste Insulinpen kam erst 1985 auf den Markt. Er löste die aufwendige Anwendung eines „Spritzbesteckes“ ab, bei dem die Patienten vor jeder Insulininjektion die Injektionsnadeln schärfen und auskochen mussten. Dies war ein weiterer Meilenstein in Punkto Lebensqualität für unzählige Betroffene.

1996 kommt mit Lispro von Lilly das erste schnell wirkende Insulinanalogon auf den Markt; das zweite war im Jahr 1998 Insulin aspart von Novo Nordisk. Beide Proteine unterscheiden sich in nur wenigen Aminosäureresten von Humaninsulin und werden von gentechnisch veränderten Bakterien hergestellt.

Entdeckung von insulinproduzierenden Zellen (I)

Ordnet die historischen Meilensteine der Insulinforschung in chronologischer Reihenfolge um das Schlüsselwort zu erhalten.

INSEL

Einheiten

3. Plasmidisolation

1. Medium vorbereiten

5. Ergebnisse

Einführung

4. Kerncurriculum

2. Plasmide

2. Plasmide

Alltagsvorstellungen, interaktive Arbeitsbläter und theoretische Einheit zu Plasmiden

Alltagsvorstellungen

Bevor wir beginnen, möchten wir zunächst wissen welche Vorstellungen ihr zu dem heutigen Thema habt. Dazu klickt ihr bitte links auf das Bild und beantwortet stichpunktartig folgende Fragen im Mentimeter.

Plasmide

Didaktik

Plasmide

Didaktik

Manche Bakterien umgeben ihre Zelle mit einer __________________. Das zähe, hochvisköse Polymer besteht aus Polysacchariden (Mehrfachzuckern) oder Aminosäuren und schützt die Bakterien vor den Fresszellen des Immunsystems.

Bis auf wenige Ausnahmen (z.B. Mykoplasmen) besitzen alle Bakterien eine ___________________. Sie verleiht ihnen die äußere Gestalt und gleicht Druckunterschiede zwischen Zellinnerem und Zelläußerem aus. Der Hauptbestandteil der bakteriellen _____________________ ist Murein. Murein (auch: Peptidoglykan) ist ein Polysaccharid (Mehrfachzucker), das lange, verzweigte Ketten bildet. Auf diese Weise bildet das Murein eine netzartige Struktur, die die gesamte Zelle umhüllt. Die _______________ besteht aus ein bis mehreren Lagen dieser Mureinnetze.

Die ____________________ hat eine wichtige Barrierefunktion. In ihr sind zahlreiche Polypeptidmoleküle eingebettet, die unter bestimmten Bedingungen einen kontrollierten Stoffaustausch zwischen dem Inneren und dem Äußeren der Zelle gestatten. So können Stoffe durch aktiven Transport in die Zelle hineingelangen oder Proteine nach außen geschleust werden. Ferner finden sich in der ___________________ Enzyme der Atmungskette und solche, die für den Aufbau der Zellwand notwendig sind.

Die DNA der Bakterien befindet sich ohne Membranbegrenzungen direkt im Zytoplasma der bakteriellen Zelle: Die doppelsträngige Bakterien-DNA liegt als sogenanntes Kernäquivalent (_________________) vor – in dieser Struktur liegt die DNA stark spiralisiert und verknäuelt vor. Auf diese Weise lässt sich Platz sparen. Im Unterschied zu menschlichen Zellen, in denen das Erbgut auf verschiedenen Chromosomen verteilt ist, ist das Erbmaterial der Bakterien als ein einziges ringförmiges Molekül organisiert und wird auch Bakterienchromosom genannt

_____________________ sind für die Translation beziehungsweise zur Synthese von Proteinen notwendig sind und kommen recht zahlreich im Cytoplasma vor: Eine einzelne bakterielle Zelle enthält rund 20.000 Stück von ihnen.

___________ sind fadenförmige Fortsätze, mit deren Hilfe sich Bakterien fortbewegen: ____________ können sich ähnlich einem Propeller oder einer Schiffsschraube um ihre eigene Achse drehen und ermöglichen eine zielgerichtete Bewegung.

Plasmide

Didaktik

Interaktive Arbeitsblätter im Biologieunterricht

Plasmide

Didaktik

Was sind Plasmide?

• kleine, in der Regel ringförmige, eigenständig replizierende DNA-Moleküle
• häufig in Prokaryoten zu finden, liegen extrachromosomal vor
• Isolation von Plasmiden ist eine der häufigsten Aufgaben des Molekularbiologen
• können sich selbstständig vermehren
• sind austausch- und übertragbar

Plasmide

Theorie

Plasmide werden unabhängig vom Chromosom repliziert.

Biologie der plasmide

Plasmide können sich selbstständig vermehren und zählen nicht zum Bakterienchromosom.

Weiter

BIOLOGIe DER PLASMIDE

Plasmide liegen ausschließlich in zirkulärer Form vor.

BIOLOGIE DER PLASMIDE

Falsch! Es gibt auch einige wenige Prokaryoten die lineare Plasmide beinhalten.

Weiter

BIOLOGIE DER PLASMIDE

Plasmide enthalten u.a. Resistenzgene gegen Antibiotika.

BIOLOGIE DER PLASMIDE

Richtig! Plasmide kodieren z. B. Enzyme, die in der Lage sind, Antibiotika zu spalten und sie dadurch unwirksam zu machen.

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BIOLOGIE DER PLASMIDE

Einheiten

1. Medium vorbereiten

2. Plasmide

5. Ergebnisse

Einführung

4. Kerncurriculum

3. Plasmidisolation

Ordnet die einzelnen Schritte der Plasmidisolation in die richtige Reihenfolge

Plasmid mit Ethanol waschen (ON)

1. Bakterienzellen abzentrifugieren (G)
2. RNA degradieren und Zellen resuspendieren (E)
3. DNA denaturieren und mit Ethanol ausfällen (I)
4. Zellteile abzentrifugieren und gelöste Plasmide abpipettieren (S)
5. Plasmide mit Isopropanol ausfällen (S)
6. Plasmid mit Ethanol waschen (E)

Prinzip der Plasmidisolation

Plasmidisolation

Praxis

Durchführung - Teil 1

• 2 ml der Bakterienkultur werden 2 min zentrifugiert (Zentrifuge austarieren!)
• den Überstand in den Abfallbeutel pipettieren
• 200 µl Lsg. 1 sowie 2 µl RNase zugeben und das Pellet durch kräftiges Anschnipsen resuspendieren
• 200 µl Lsg. 2 zugeben, 3x invertieren
• 200 µl Lsg. 3 zugeben, 3x invertieren
• 1 min auf Eis inkubieren
• für 2 min zentrifugieren (Zentrifuge austarieren!)
• den klaren Überstand mit einer Pipette abnehmen und in neues Reaktionsgefäß überführen
• den überführten Überstand erneut für 2 min zentrifugieren den Überstand in ein neues Reaktionsgefäß überführen (nur klare Flüssigkeit pipettieren)

Plasmidisolation

Praxis

25 mM Tris-HCl pH 8,0;50 mM Glucose; 10 mM EDTA pH 8,0

0,2 M NaOH; 1 % SDS

60 ml 5 M Kaliumacetat; 11,5 ml Eisessig; 28,5 ml H2O

Durchführung - Teil 2

Plasmidisolation

Praxis

• Zugabe von 600 µl Isopropanol zum Überstand, gut mischen
  
• 5 min auf Eis inkubieren
  
• für 2 min zentrifugierenden Überstand in den Abfallbeutel pipettieren
  
• 1 ml 70 % Ethanol auf das Pellet pipettieren, Pellet nicht resuspendieren
  
• für 1 min zentrifugieren
  
• Ethanol sehr sorgfältig mit der Pipette abnehmen ohne das Pellet zu zerstören
  
• Pellet bei Raumtemperatur trocknen (Reaktionsgefäß offen stehen lassen)
  
• DNA in 30 µl H2O aufnehmen
  

- Plasmidpellet am Boden

Einheiten

1. Medium vorbereiten

2. Plasmide

5. Ergebnisse

Einführung

4. Kerncurriculum

3. Plasmidisolation

Das neue KC 2022

Kerncurriculum

Didaktik

• neues KC seit 2022
• relevant für uns im Referendariat
• neue Strukturierung
• Eine Tabelle für jeden Themenschwerpunkt mit Kompetenzen in direkter Übersicht

Welche Probleme habt ihr bei der Aufgabe festgestellt?

Das neue KC 2022

Kerncurriculum

Didaktik

• Im neuen KC der Sek II kaum molekularbiologische Methoden vertreten.
• Lediglich PCR und Gelelektrophorese werden erwähnt.
• Dafür aber: 2.3 Fachkompetenz in der digital basierten Welt
• Interaktives Arbeitsblatt
• Lernvideos

Einbindung von Klonierung in das KC

Kerncurriculum

Didaktik

Einheiten

1. Medium vorbereiten

2. Plasmide

Einführung

4. Kerncurriculum

5. Ergebnisse

3. Plasmidisolation

• Nach dem Autoklavieren Medien abkühlen lassen, bis die Flaschen „anfassbar“ sind. Achtung: Agar darf nicht fest werden!
• Vor dem Gießen sterile Zugabe der entsprechenden Zusätze, und erneut aufrühren, damit der Agar und die Zusätze gleichmäßig im Medium verteilt vorliegt
• Gießen von ca. 25 ml Medium pro kleiner Agarplatte (9 cm ∅) und abkühlen lassen.
• Platten bei 4 °C lagern.

Agarplaten gießen

Medium vorbereiten

Methode

am besten in einem Wasserbad, dabei unbedingt rühren

wenn benötigt, z. B. Antibiotika

Ihr habt heute schon ein wenig über Plasmide und ihren Nutzen für

Ergebnisse

Nächste Woche geht es weiter mit...

Ergebnisse

Einheiten

1. Medium vorbereiten

2. Plasmide

5. Ergebnisse

Einführung

4. Kerncurriculum

3. Plasmidisolation

Quellenverzeichnis