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Licence Professionnelle OBQI

Session 2021-2022

Mise en place d'une méthode non normalisée pour tester la sensibilité des souches internes

Lisa gicquel

Alexandre

noblecourt

Julien

matysiak

Tuteurs :

01

Sommaire

1. Introduction

2. Présentation de l'entreprise

3. Mes activités réalisées au laboratoire

4. Ma thématique d'alternance et son intérêt

5. Conclusions et perspectives

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  • Préparation des consommables, métrologie, projet interne, contrôle air et surfaces, gestion du souchier


  • Mise en place d'une méthode non normalisée pour tester la sensibilité des souches en interne (remplacer la NF EN 1040)

1. Introduction

* Suivi de croissance bactérienne/ utilisation d'un lecteur de microplaque

03

2. Présentation de l'entreprise

ISO 17 025

Biocide :

évaluation de l'efficacité des désinfectants

Challenge test : évaluation de l'efficacité des conservateurs

Désinfectants, antiseptiques, cosmétiques, pharmaceutiques

Laboratoire MIDAC

Bactéries, levures,

moisissures, virus

Contrôle qualité :

évaluation de la conformité des produits / dosage des antibiotiques

04

Préparation du matériel

Préparation des milieux

3. Mes activités réalisées au laboratoire

-



Figure 1 : Fiche préparation du milieu BHIY-L

- Pesée, dissolution, mesure du pH, conditionnement, stérilisation

- Géloses

- Bouillons ( chimiques ou nutritifs) -Substances interférentes

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Métrologie

3. Mes activités réalisées au laboratoire

Vérification de l'etuve

Vérification : confirme que l'erreur de mesure est plus petite que l'EMT

Etalonnage : estime l'erreur de l'instrument afin de la corriger pour la compenser
Objectif : s'assurer de la conformité du matériel et donner des résultats de qualité

Figure 2 : Cartographie d'une étuve à 32,5°C +/- 2,5°C

06

Métrologie

3. Mes activités réalisées au laboratoire

Etalonnage des thermomètres


- Comparaison de la température lue avec la température du thermomètre étalon


Figure 3 : Etiquette mise sur le thermomètre avec la correction associée

Vérification des pipettes

- Vérification : volume prélevé = volume réel


Projet matériel

-Répertorier tout le matériel du laboratoire
- Faciliter la gestion du matériel

Contrôle air et surfaces

Objectif : mesurer l'indice d'hygiène pour s'assurer de la propreté du laboratoire

-Nombre de colonies < critère => conforme
-Nombre de colonies > critère => Non conforme / Nettoyage

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4. Ma thématique d'alternance et son intêret

- Tester la sensibilité -> Vérifier l'absence de mutations

-Evaluation de l'activité bactéricide de base des antiseptiques et désinfectants chimiques

- Connaître l'activité face à différentes concentrations de produits

- 5 minutes à 20°C

- Réduction de 5 log du nombre de bactéries = concentration bactéricide

Mise en place du projet

NF EN 1040

08

4. Ma thématique d'alternance et son intêret

- Réalisation de 2 suspensions pour la numération (1 pour les essais, 1 pour les témoins) : détermine le nombre de micro-organismes présent au départ

- Réalisation de 3 témoins :
Témoin A : validation des conditions expérimentales et vérifier l’absence d’effet létal des conditions
Témoin B : vérification de l’absence de toxicité du neutralisant
Témoin C : Validation de la dilution-neutralisation

- Réalisation des essais : On met en contact le produit sur les micro-organismes 5 minutes à 20°C puis on neutralise


Figure 4: Résultats des tests de sensibilité sur deux ans


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Demarche scientifique

-Mise en contact d'une concentration non inhibitrice d'agents anti-microbiens avec des suspensions de bactéries

Mise en place d'une méthode non normalisée pour tester la sensibilité des souches internes

4. Ma thématique d'alternance et son intêret

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4. Ma thématique d'alternance et son intêret

cROISSANCE BACTérienne

Ln (Do)

Figure 5 : Courbe de croissance bactérienne Ln(Do) = f(t)

-Suivi de la croissance grâce aux mesures de la densité optique

- 6 phases distinctes

-Détermination de la vitesse spécifique de croissance = vitesse de multplication "µ" en h-1


Courbe de croissance

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Heure

4. Ma thématique d'alternance et son intêret

cROISSANCE BACTérienne

Ln (Do)

Figure 6 : Courbes de croissance bactérienne en absence et en présence d'agent anti-microbien

-Recherche d'une concentration qui ralentit la vitesse spécifique de croissance

- Concentration inhibitrice = pas de croissance bactérienne


Courbes de croissance en présence d'agent anti-microbien

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4. Ma thématique d'alternance et son intêret

cROISSANCE BACTérienne

Paramètres étudiés

-En absence et en présence de phénol pour chaque souche

- Pour la vitesse spécifique de croissance : la moyenne, la valeur minimale, la valeur maximale, l'écart-type et l'incertitude élargie

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4. Ma thématique d'alternance et son intêret

mise en place du projet

Choix des souches et du produit

Escherichia coli
Bacille G-

Staphylococcus aureus
Coque G+

Enterococcus hirae
Coque G+

Pseudomonas aeruginosa
Bacille G-

Phénol

Lecteur de microplaque

Figure 7 : Multiskan FC de chez ThermoScientific

- λ = 620nm


- Agitation faible

- T°C incubation : 30°C

- Présence d'un film adhésif => éviter l'évaporation

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4. Ma thématique d'alternance et son intêret

Mise en place du projet

choix du bouillon

Bouillon Tryptone soja

Bouillon mueller-hinton

- 50µL de supsension à 0.2 Do + 50 µL de bouillon (x3)

-=> Milieux nutritifs qui permettent la croissance des bactéries

Figure 8: Courbes de croissance en fonction du temps en TSB

Ln(Do)=f(t)

Figure 9: Courbes de croissance en fonction du temps en BMH

Ln(Do)=f(t)

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4. Ma thématique d'alternance et son intêret

Mise en place du projet

Paramètres de la vitesse spécifique

pour chaque souche sans phénol

- Réalisé 10 fois pour chaque souche = reproductibilité


- Objectif : Obtenir un intervalle de valeurs pour lequel la manipulation (contrôle de croissance) sera valide/conforme

Figure 10 : Résultats de l'incertitude pour les vitesses spécifiques de croissance de chaque souche

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4. Ma thématique d'alternance et son intêret

Mise en place du projet

choix de la concentration

- Gamme de dilutions de phénol allant de 0 à 0,5%

- Suivi de la densité optique pendant 12h

Figure 11: Courbes de croissance de S.aureus en présence de phénol 0 à 0,5%


Figure 12 : Courbes de croissance de E.hirae en présence de phénol 0 à 0,5%


- 50 µL de suspension à 0,2 Do + 50 µL de produit

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4. Ma thématique d'alternance et son intêret

Mise en place du projet

choix de la concentration

Figure 13 : Courbes de croissance de E.coli en présence de phénol 0 à 0,5%


Figure 14: Courbes de croissance de P.aeruginosa en présence de phénol 0 à 0,5%


- 0,1% pour Staphylococcus aureus

- 0,1% pour Pseudomonas aeruginosa

- 0,1% pour Escherichia coli

- 0,3% pour Enterococcus hirae

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4. Ma thématique d'alternance et son intêret

Mise en place du projet

Comparaison des courbes et détermination des paramètres de la vitesse spécifique de croissance

Figure 15 : Courbes de croissance de P.aeruginosa en présence et en absence de phénol à 0,1%


Figure 16 : Cartographie des valeurs "µ" en h-1 pour P.aeruginosa


-Valide/conforme : si la valeur est comprise entre 0,1196 et 0,2396 h-1


Absence de phénol


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4. Ma thématique d'alternance et son intêret

Mise en place du projet

Comparaison des courbes et détermination des paramètres de la vitesse spécifique de croissance

Figure 17 : Courbes de croissance de S.aureus en présence et en absence de phénol à 0,1%


Figure 18 : Cartographie des valeurs "µ" en h-1 pour S.aureus


-Valide/conforme : si la valeur est comprise entre 0,2372 et 0,3972 h-1


Absence de phénol


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4. Ma thématique d'alternance et son intêret

Mise en place du projet

Comparaison des courbes et détermination des paramètres de la vitesse spécifique de croissance

Figure 19: Courbes de croissance de E.coli en présence et en absence de phénol à 0,1%


-Valide/conforme : si la valeur est comprise entre 0,3276 et 0,3676 h-1


Absence de phénol


Figure 20: Courbes de croissance de E.hirae en présence et en absence de phénol à 0,3%


Absence de phénol


-Valide/conforme : si la valeur est comprise entre 0,2406 et 0,3206 h-1


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5. Conclusions et perspectives

" Mise en place d'une méthode non normalisée pour tester la sensibilité des souches internes"

- 0,4436 ± 0,1 pour P.aeruginosa


- 0,4796 ± 0,08 pour S.aureus

- 0,4581 ± 0,04 pour E.coli
- 0,3506 ± 0,02 pour E.hirae

- 0,1796 ± 0,06 pour P.aeruginosa


- 0,3172 ± 0,08 pour S.aureus

- 0,3476 ± 0,02 pour E.coli

- 0,2806 ± 0,04 pour E.hirae

Nouvelles souches

Produit moins dangereux

Détermination du nombre de bactéries final / temps des phase de latence

Nouvelle méthode d'inoculation de la souche

Sans phénol

Avec phénol

Autonomie

Travail en équipe

Sens de l'organisation

Projet : Master Management des risques QSE & RSE

Intéressant de voir le comportement des souches dans différentes conditions

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MERCI DE VOTRE ATTENTION

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