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Transcript

Bioproduction de GFP
recombinante par agro-infiltration
chez Nicotiana Benthamania

pEAQ-HT-GFP

Temoin positif avec la séquence de GFP

Plasmide avec P19 (qui est un inhibiteur de silencing d'origine virale) que l'on va transfecter avec pCP60

Objectifs

Vecteur binaire sans transgène, témoin négatif

Ajout de RdRp qui va pemettre de transcrire les transcrit et donc d'augmenter laproduction de protéines. On ajoute aussi MP qui est une protéine de mouvement pour se déplacer entre les cellules via le plasmodesme. Approche de magnification

Sur ce plasmide on ajoute en plus des P19 des UTR viraux qui stabilisent le transgène et permet une meilleur fixation du ribosome en 5'

Lors de ce Tp on va mesurer l’efficacité de production de protéines d'intérêt dans un modèle végétal, ici Nicotiana benthamiana, via une transformation bactérienne transitoire.

Pour cela nous utiliserons différents plasmides ayant des cassettes T-ADN différentes et ainsi savoir quel plasmide propose le meilleur rendement de production protéique.

Dans un premier temps on a choisi comme modèle Nicotiana Benthamiana pour ses capacités de croissances rapides mais également car elle tolère bien la transformation à notre vecteur bactérien ici agrobactérium.

On va donc procéder à une agro-transformation avec des plasmides ayant des constructions différentes pour déterminer quelles cassettes sont les plus adaptés pour l'optimisation de la production protéique.

Pour cela on va normaliser la concentration bactérienne ayant un plasmide différent pour pouvoir comparer l'efficacité des différentes construction de ces plasmide. Pour cela on cherche à obtenir une DO de 1 pour notre uniculum bactérien afin d'avoir le meilleur rapport de densité bactérienne possible pour faire notre transfection.

Observation des feuilles infiltrées par Agrobacterium

pTRBO-GFP

Observation :

Plutôt forte fluorescence en comparaison des autres infiltrations.

Intérprétation :

La présence de la rdrp à bien permis de produire plus de GFP en augmentant le taux de transcrits.



Observation :

Pour pCP60-GFP+P19 on observe une forte fluorescence puis celle-ci baisse jusqu'a quasiment diparaître pour pCP60

Intérprétation :

Pcp60 est le témoin négatif donc c'est normal que l'on observe presque rien hormis une petite auto-fluorescence bleue correspondant aux composés phénoliques dus à la réaction de défense.

Pour pCP60-GFP, l'augmentation est dû à la présence d'une cassette GFP dans le vecteur ainsi que de l'auto-fluorescence bleu.

Pour pCP60-GFP-P19, la forte fluorescence résulte de l'ajout du plasmide contenant une cassette p19 qui est un supresseur de silencing virale. Celui-ci va donc éviter la régulation négative de l'ARN de la GFP qui est mise en oeuvre pour pallier la surexpression de la GFP

Pour pEAQ-HT-GFP, la présence de stabilisateurs de l'ARN et de p19 aurait dû donner la plus forte production de GFP et donc la plus faute fluorescence.

pcp60

pcp60gfp

pEAQ-HT-GFP

pCP60-GFP+P19

Agrobactérium avec plasmide pCP60

centrifugation

Culot +MgCl2
DO de 1

pCP60

pCP60-GFP

P19

pEAQ

pTRBO

x5

Agro-infilatration

mélange avec MgCl2 ou p19

Suspension d'agrobactériums et agro-infilatration de N.benthamiana

Extraction et purification de la GFP

Ici nous allons chercher à déterminer le taux de production de GFP recombinante en fonction d'une quantité de feuille. Nous allons tout d'abord broyer les feuilles totalement infiltrées dans un tampon de broyage. Lorsqu'il y a plus de fragments de tissus visibles on clarifie notre extrait protéique. Puis nous réalisons une chromatographie d'affinité avec du nickel grâce à l'HisTag qui est en C-Term de la GFP. Enfin après la récupération de l'éluat de la chromatographie, nous regardons nos tubes sous UV et nous prenons ceux avec le plus de fluorescence et donc de GFP (ce que l'on devait faire mais le tampon de lavage était trop fort et a enlevé trop de GFP donc nous utilisons d'autres échantillons).

Explication

Observation

HisTag

Nous pouvons observer que la fluorescence apparaît surtout après le tube 4, ceci est normal car la colonne fait 1 ml donc le temps que le tampon d'élution NPI250 chasse le tampon de lavage NPI20 il y a déjà 1 ml qui s'est écoulé (4 x 250 µl donc 4 tubes). Nous observons un maximum de fluorescence pour le tube 6, puis celle-ci redescend, ce qui montre bien que la GFP a bien été éluée et qu'il en reste presque plus dans la colonne NiNTA.

2ml NPI250

Tampon + sable + DTT

Broyage

Centrifugation

Broyat

Extrait protéique

Synopsis

Etapes de Purification

Eluat avec GFP visible sous UV

Colonne

Nickel

Fixation

Lavage

Elution

Eluat x8

NPI20

GFP

1

2

3

4

5

6

7

8

Photographie sous UV des 8 tubes contenant chacun 250 µl de l'élution de la chromatographie d'affinité pour révéler la présence de GFP

Ils sont classés dans l'ordre du recueil de l'éluat

HisTag

Feuille pEAQ

NPI250

Extraction et purification de la GFP

On va chercher ici à déterminer la concentration en GFP présente dans nos extraits végétaux via une courbe de référence à la BSA.

On obtient ainsi la courbe si contre, nous donnant l'équation de droite suivante : Absorbance = 0.0466 x concentration en protéines.

Ainsi pour nos deux dilutions (On doit impérativement diluer nos échantillons contenant de la GFP car dépassé 1.4 l'évolution de l'absorbance n'est plus linéaire ce qui fausserait nos calculs de concentration)

On obtient les concentration en GFP suivante :
1/10 : (1.26/0.0466)x10 = 270 µg/mL
1/20 : (0.588/0.0466)x20 = 252 µg/mL
Soit une moyenne de 263 µg de GFP par mL d'extrait protéique issus du broyage de nos plantes. Ce qui correspond à 0.263 g (car 1L = 1KG) de GFP pour les 2.25g de feuilles collectées initialement.

On obtient ainsi un rendement de (100x0.263)/2.25 = 11,7% environ pour notre plantes transféctées par pEAQ-HT-GFP.

Tout d'abord nous avons une cassette p19, qui est un supresseur de silencing virale, qui a montré son efficacité lors de son agro-infiltration avec pCP60.
Puis nous avons le vecteur pTRBO, qui possède une RdRp qui va permettre de transcrire les transcrits et donc d'augmenter la production de protéines. Celui-ci a aussi montré son efficacité lors de l'agro-infiltration en révélant, sous UV la plus forte fluorescence et donc le plus fort taux de GFP en comparaison des autres taches correspondant aux autres vecteurs.

Conclusion

Donc la bioproduction de GFP par l'agro-infiltration de ces Nicotiana benthamiana avec des bactéries possédants différents types de plasmides nous a permis de mettre en évidence les éléments indispensables pour obtenir le meilleur rendement de GFP.

pCP60-GFP+P19

Pour augmenter le rendement, nous pourrions penser à utiliser ces deux vecteurs en même temps. pTRBO permettrait de produire encore plus de transcrits et donc de protéines (ici de la GFP) et p19 permettrait de protéger cette grande quantité de transcrits en inhibant le silencing qui serait automatiquement mis en place face à un aussi grand nombre de transcrits.

pTRBO-GFP

Nous avons aussi réussi à atteindre un rendement de 11,7% avec pEAQ suite à une purification par chromatographie d'affinité. Ce rendement est peut être bien mais nous n'avons aucun moyen de le savoir car il n'y a aucune comparaison possible, nous avons juste testé avec pEAQ.