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Le génotypage des séquences Alu locus PV92

Thème 1, chapitre 3 : génome humain et histoire de l'humanité

Le génotypage correspond à une science qui a pour objectif de définir, chez une personne ou un groupe d'êtres de la même espèce, les caractéristiques d'une variation génétique du génome dans son ensemble ou d'une partie de celui-ci.

Doc 1. Le principe et le déroulement de la rétrotransposition (Nature)

Mécanisme d’insertion par rétroposition d’un élément Alu humain
D’après « Alu repeats and human genomic diversity » MA Batzer, PL Deininger - Nature reviews genetics, 2002 - nature.com


Doc 2. L’expansion des séquences Alu chez les primates (Nature)

L’expansion des sous-familles (Ya5a2, Yb9, Yb8, Y, Sg1, Sx and J) est superposée à l’arbre des primates. L’expansion des différentes sous familles Alu est identifiée par les carrés de couleurs, ce qui permet de visualiser la durée de chaque pic d’amplification. Le nombre approximatif de copies de chaque sous famille Alu est également indiqué.

D’après« Alu repeats and human genomic diversity » MA Batzer, PL Deininger - Nature reviews genetics, 2002 - nature.com




Doc 3. Exemple d'études réalisées à partir des variations des insertions Alu au niveau de différentes population humaine (Nature)

Sur cette carte, chaque numéro renvoie à une population humaine dont le profil génotypique en ce qui concerne les séquences Alu, est proche.

Dans le tableau ci-dessous, sont relevés, pour chaque population humaine présentée dans le doc. 1, les taux de distribution des séquences Alu (génome homozygote ++, et hétérozygote +-) pour les 3 loci TPA25, PV92, APO.


Quest-ce que la phylogénie ? Étude de l'évolution des êtres vivants et des liens de parenté qui existent entre eux. Les méthodes génétiques ont permis des progrès considérables...

Doc 4. L'électrophorèse et son principe

Principe de l’électrophorèse. Il s’agit d’une technique de laboratoire permettant de séparer des molécules (protéines , fragments d’ADN, ...) grâce à leur différence de masse et de charge électrique en présence d'un champ électrique. Par exemple les nucléotides de l’ADN étant tous chargés électronégativement, tout fragment d’ADN migrera de la cathode vers l’anode et plus la masse du fragment est élevée plus le fragment restera proche de la cathode (voir schémas ❶ et ❷ ci dessous). L’électrophorèse permet de traiter simultanément plusieurs échantillons en même temps en déposant différents échantillons dans les puits du gel.

Doc 6. La Taq polymérase (Belin)

En 1976, des scientifiques ont réussi à isoler l'ADN polymérase d'une bactérie thermophile (= qui peut vivre dans des milieux de température élevée). Alors que l'ADN polymérase de la plupart des êtres vivants est détruite au-dessus de 45°C, la polymérase de ces bactéries (= la Taq polymérase) supporte une température de 100°C. La découverte de cette enzyme a permis, à la fin des années 1980, la mise au point d'une technique qui a révolutionné la biologie : la PCR (Polymerase Chain Reaction).

Source d'eau chaude dans le parc national de Yellowstone aux États-Unis. C'est là dans des eaux à plus de 70°C, qu'a été isolée la bactérie Thermus aquaticus dont la polymérase (Taq polymérase) supporte des températures élevées.

Remarque : dans la manipulation, la Taq polymérase est contenue dans le tube PCR Mix qui contient aussi des nucléotides libres.

Doc 5. Des amorces d'ADN nécessaires à la réplication

En biologie moléculaire, l'amorce est une courte séquence d'ARN ou d'ADN, complémentaire du début d'une matrice, servant de point de départ à la synthèse du brin complémentaire de cette dernière matrice par une ADN polymérase.

Ainsi, dans une PCR, il est nécessaire "d'amorcer" la réplication à chaque cycle. En effet, seule la séquence amorcée par une petite séquence d'ADN simple brin déposée en début de PCR, sera amplifiée (= multipliée). Cette amorce permet aussi en quelque sorte de "choisir" la séquence d'ADN à amplifier (ici potentiellement les séquences Alu) car elle est complémentaire du début de la séquence d'intérêt.

Remarque : les amorces sont ici contenues dans le tube Primer Mix.




Doc 7. La PCR, une "photocopieuse" à ADN (Belin)

Principe général de la réaction PCR. La première étape de cette réaction consiste en la dénaturation de l’ADN double brin qui sert de matrice. Pour se faire, la solution d’ADN est chauffée à une température proche de l’ébullition ce qui permet de séparer les deux brins d’ADN. La seconde étape consiste à apparier, de part et d’autre de la zone à amplifier, des amorces d’ADN simple brin synthétique. Cette opération est simplement réalisée en abaissant suffisamment la température pour que cet appariement puisse être stable. La troisième et dernière étape consiste à se placer à la température optimale pour la synthèse d’ADN par l’ADN Taq polymérase (typiquement 72°C), cela pendant le temps nécessaire pour que cette dernière ait le temps de synthétiser la longueur d’ADN souhaitée.

Ces trois étapes vont être répétées (n cycles) autant de fois que nécessaire pour amplifier de façon exponentielle le morceau d'ADN recherché. Typiquement, la molécule d’origine va pouvoir ainsi être multipliée par des facteurs de 106 à 109 la rendant détectable par électrophorèse sur un gel d’agarose.

Doc 8. La séquence Alu

Les séquences Alu sont des courts fragments d'ADN appartenant à la famille des petits éléments nucléaires intercalés ou SINE (short interspersed nuclear element). Longues d'environ 300 pb, ne comportant aucun gène et réparties dans l'ensemble des chromosomes, elles sont les séquences les plus abondantes du génome humain (1 090 000 séquences Alu), ce qui représente environ 10 % du génome humain !

Doc 9. Les résultats d'une électrophorèse

À l'issue d'une électrophorèse, on obtient un gel avec des tâches qui ont migré depuis la ligne de dépôt (où sont situés les puits) :

Le bon protocole ?