Molecular Biologie 4
julien
Created on March 2, 2022
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Transcript
molecular biology
Index
1. Systèmes de détection de la PCR quantitative
Le SYBR Green
Composants de la réaction avec le SYBR Green:
- Intercalant ADN qui a la capacité de se lier aux acides nucléiques et d'émettre une fluorescence
- Forte fluorescence pour les ADN double brins et faible fluorescence pour les ADN simple brin
Le SYBR Green
Avantages
- Facile d’utilisation
- Peut être utilisé avec n’importe quelle séquence d’ADN
- Moins toxique que le Bromure d’éthidium
- Le plus utilisé dans les laboratoires
- Non spécifique pour un ADN double brins
- Non spécifique à une séquence d’ADN (ex: détection de 2 allèles dans le même échantillon n’est pas possible)
Inconvénients
La sonde Taqman
- Oligonucléotide qui est attaché à un fluorophore à l’ extrémité 5’ et un suppresseur (inhibiteur) à l’ extrémité 3’.
- Activité exonucléase de l’enzyme d’ADN Taq polymérase.
La sonde Taqman
Avantages
- Haute sensibilité
- Haute spécificité de la sonde pour sa séquence complémentaire
- Possibilité de faire un détection multiplex
- Rapide
- Utilisée pour différents buts
- Protocol difficile à développer (nécessité de 2 amorces et 1 sonde pour hybridizer)
- Relativement chère
Inconvénients
2. Droplet digital PCR (ddPCR)
- Permet d'analyser de très faible quantités d'échantillons
- Quantification des virus, mi-RNA, mesure expression des gènes et recherche de mutations dans les maladies génétique
3. Séquencage d'ADN
Fevrier 2001 : premier project de séquence du génome humain
Technique determinant l'ordre et nature des nulcéotides dans un fragments d'ADN
- A partir de séquence de nucléotides d'un gène
- Connaissance des sites exacts de restriction
- Savoir si un patient possede une mutation dans son ADN
Séquencage par terminaison de chaines
dNTP et ddNTP
Deoxy-nucléotide (dNTP)
- Unité de base de l'ADN
- Elongation d'un fragment d'ADN par ajout d'un nouveau dNTP grâce au groupement -OH en 3'
Dideoxynucléotide (ddNTP)
- Produit artificiel à partir de dNTP
- Différencier des dNTP par l'absence du groupement -OH en position 3'
- 4 types de ddNTP
Différent Types de ddNTP
ddATP
ddGTP
La réaction
- Réplication d'un fragment d'intérêt
- Dans 4 tubes différents contenant chacun :
- la matrice d'ADN
- Amorces
- ADN Taq polymérase
- dNTP
- Un seul type de ddNTP (ddATP/ddCTP/ddTTP/ddGTP)
- Taq choisit aléatoirement le nucléotide suivant.
A G C T C A A G C T A T C C G
Si Taq ploymérase utilise :
un dNTP = la réplication continueun ddNTP = la réplication stop.
A G C T C A A G C T A T C C G
- Fragment de poids moléculaire.
- Analyse par électrophorèse, un tube par piste.
- Plus le fragment est petit, plus il ira loin.
- Plus petit fragment = fragment dont l'élongation s'est arrêtée au 1er nucléotide.
ddATP ddCTP ddGTP ddTTP
1
2
3
4
5
6
7
8
9
T
T
T
G
G
G
C
A
C
C
Séquençage moderne
- plus besoin de séparer les ddNTP
- Utilise un seul piste
- ddNTP associé avec un colorant différent.
- séquençage réalisable à l'oeil nu.
ddNTP
C
G
MERCI