Molecular Biologie 4

molecular biology

Index

1. Systèmes de détection de la PCR quantitative

Le SYBR Green

Composants de la réaction avec le SYBR Green:

• Intercalant ADN qui a la capacité de se lier aux acides nucléiques et d'émettre une fluorescence
• Forte fluorescence pour les ADN double brins et faible fluorescence pour les ADN simple brin

Le SYBR Green

Avantages

• Facile d’utilisation
• Peut être utilisé avec n’importe quelle séquence d’ADN
• Moins toxique que le Bromure d’éthidium
• Le plus utilisé dans les laboratoires

• Non spécifique pour un ADN double brins
• Non spécifique à une séquence d’ADN (ex: détection de 2 allèles dans le même échantillon n’est pas possible)

Inconvénients

La sonde Taqman

• Oligonucléotide qui est attaché à un fluorophore à l’ extrémité 5’ et un suppresseur (inhibiteur) à l’ extrémité 3’.
• Activité exonucléase de l’enzyme d’ADN Taq polymérase.

La sonde Taqman

Avantages

• Haute sensibilité
• Haute spécificité de la sonde pour sa séquence complémentaire
• Possibilité de faire un détection multiplex
• Rapide
• Utilisée pour différents buts

• Protocol difficile à développer (nécessité de 2 amorces et 1 sonde pour hybridizer)
• Relativement chère

Inconvénients

2. Droplet digital PCR (ddPCR)

- Permet d'analyser de très faible quantités d'échantillons

- Quantification des virus, mi-RNA, mesure expression des gènes et recherche de mutations dans les maladies génétique

3. Séquencage d'ADN

Fevrier 2001 : premier project de séquence du génome humain

Technique determinant l'ordre et nature des nulcéotides dans un fragments d'ADN

• A partir de séquence de nucléotides d'un gène

• Connaissance des sites exacts de restriction

• Savoir si un patient possede une mutation dans son ADN

Séquencage par terminaison de chaines

dNTP et ddNTP

Deoxy-nucléotide (dNTP)

- Unité de base de l'ADN

- Elongation d'un fragment d'ADN par ajout d'un nouveau dNTP grâce au groupement -OH en 3'

Dideoxynucléotide (ddNTP)

- Produit artificiel à partir de dNTP

- Différencier des dNTP par l'absence du groupement -OH en position 3'

- 4 types de ddNTP

Différent Types de ddNTP

ddATP

ddGTP

La réaction

• Réplication d'un fragment d'intérêt
• Dans 4 tubes différents contenant chacun :
• la matrice d'ADN
• Amorces
• ADN Taq polymérase
• dNTP
• Un seul type de ddNTP (ddATP/ddCTP/ddTTP/ddGTP)

• Taq choisit aléatoirement le nucléotide suivant.

A G C T C A A G C T A T C C G

Si Taq ploymérase utilise :

un dNTP = la réplication continue

un ddNTP = la réplication stop.

A G C T C A A G C T A T C C G

• Fragment de poids moléculaire.
• Analyse par électrophorèse, un tube par piste.
• Plus le fragment est petit, plus il ira loin.
• Plus petit fragment = fragment dont l'élongation s'est arrêtée au 1er nucléotide.

ddATP ddCTP ddGTP ddTTP

1

2

3

4

5

6

7

8

9

T

T

T

G

G

G

C

A

C

C

Séquençage moderne

• plus besoin de séparer les ddNTP
• Utilise un seul piste
• ddNTP associé avec un colorant différent.
• séquençage réalisable à l'oeil nu.

ddNTP

C

G

MERCI