Want to make creations as awesome as this one?

Transcript

molecular biology

DATE : 02/03/2022
ENSEIGNANT : N.LEBSIR
GROUPE 3 : BEAUDROT Emma, BARBEREAU audrey, LEDIG Julien, LEFEUVRE Rozenn

Index

1. Systèmes de détection pour la PCR quantitative

2. Droplet Digital PCR

3. Séquençage d'ADN

1. Systèmes de détection de la PCR quantitative

Le SYBR Green

Composants de la réaction avec le SYBR Green:

- Taq polymérase (thermorésistante)
- 2 amorces
- dNTP
- ADN ou ADNc
- SYBR Green
=> Le tout dans une solution tampon

  • Intercalant ADN qui a la capacité de se lier aux acides nucléiques et d'émettre une fluorescence
  • Forte fluorescence pour les ADN double brins et faible fluorescence pour les ADN simple brin

Le SYBR Green

Avantages

  • Facile d’utilisation
  • Peut être utilisé avec n’importe quelle séquence d’ADN
  • Moins toxique que le Bromure d’éthidium
  • Le plus utilisé dans les laboratoires

  • Non spécifique pour un ADN double brins
  • Non spécifique à une séquence d’ADN (ex: détection de 2 allèles dans le même échantillon n’est pas possible)

Inconvénients

La sonde Taqman

  • Oligonucléotide qui est attaché à un fluorophore à l’ extrémité 5’ et un suppresseur (inhibiteur) à l’ extrémité 3’.
  • Activité exonucléase de l’enzyme d’ADN Taq polymérase.


5 étapes:

1) Dénaturation

2) Hybridation

3) Elongation (réplication du brin complémentaire par ajout de dNTP à l’extrémité 3’ de l’amorce)

4) Clivage de la sonde et détachement du fluorophore

5) Emission de la fluorescence et quantification par l’automate de PCR

La sonde Taqman

Avantages

  • Haute sensibilité
  • Haute spécificité de la sonde pour sa séquence complémentaire
  • Possibilité de faire un détection multiplex
  • Rapide
  • Utilisée pour différents buts

  • Protocol difficile à développer (nécessité de 2 amorces et 1 sonde pour hybridizer)
  • Relativement chère

Inconvénients

2. Droplet digital PCR (ddPCR)

- Division de l'échantillon et d'une sonde ou un agent fluorescent en goutelettes de taille et de volume identique
- Une molécule par goutelette
- Fluorescence de chaque goutelette témoigne de la présence de l'échantillon
- Avec un lecteur de goutelette, on obtient 1 pour une goutelette positive (fluorescente) et 0 pour une goutelette négative
- Utilisation de la loi de Poisson

Principe

- Permet d'analyser de très faible quantités d'échantillons

- Quantification des virus, mi-RNA, mesure expression des gènes et recherche de mutations dans les maladies génétique

3. Séquencage d'ADN

Fevrier 2001 : premier project de séquence du génome humain

Technique determinant l'ordre et nature des nulcéotides dans un fragments d'ADN

  • A partir de séquence de nucléotides d'un gène

  • Connaissance des sites exacts de restriction

  • Savoir si un patient possede une mutation dans son ADN

Séquencage par terminaison de chaines

dNTP et ddNTP

Deoxy-nucléotide (dNTP)

- Unité de base de l'ADN

- Elongation d'un fragment d'ADN par ajout d'un nouveau dNTP grâce au groupement -OH en 3'

Dideoxynucléotide (ddNTP)

- Produit artificiel à partir de dNTP

- Différencier des dNTP par l'absence du groupement -OH en position 3'

- 4 types de ddNTP

Différent Types de ddNTP

ddATP

ddGTP

ddCTP

ddTTP

La réaction

  • Réplication d'un fragment d'intérêt
  • Dans 4 tubes différents contenant chacun :
    • la matrice d'ADN
    • Amorces
    • ADN Taq polymérase
    • dNTP
    • Un seul type de ddNTP (ddATP/ddCTP/ddTTP/ddGTP)
  • Taq choisit aléatoirement le nucléotide suivant.

A G C T C A A G C T A T C C G

T C G A G T T

G

C

A

A

T

Si Taq ploymérase utilise :

un dNTP = la réplication continue
un ddNTP = la réplication stop.

Obtention de nombreuses copies du fragment : taille et poids moléculaire différents.

A G C T C A A G C T A T C C G

T C G A G T T

G

C

La révélation

  • Fragment de poids moléculaire.
  • Analyse par électrophorèse, un tube par piste.
  • Plus le fragment est petit, plus il ira loin.
  • Plus petit fragment = fragment dont l'élongation s'est arrêtée au 1er nucléotide.


ddATP ddCTP ddGTP ddTTP

Taille du fragment

Séquence déduite

1

2

3

4

5

6

7

8

9

T

T

T

G

G

G

C

A

C

C


G
A

A

C
T

C
G
A

Séquençage moderne

  • plus besoin de séparer les ddNTP
  • Utilise un seul piste
  • ddNTP associé avec un colorant différent.
  • séquençage réalisable à l'oeil nu.

Exemple :

ddATP : Rouge
ddCTP : Jaune
ddGTP : Vert
ddTTP : Bleu

ddNTP

Séquence déduite

C

G
A
A

C
T
C

G

A

G

C
T
T

G
A
G

C

T

Séquence déterminée

MERCI