Croissance d'E. coli en Erlenmeyer

Protocole 2 : Suivi de croissance d'E. coli en milieu non glucosé (fiole d'Erlenmeyer)

C'est parti !

Sommaire

De la préparation du milieu à l'analyse des résultats

II.

III.

I.

Préparation de la solution de gluose

Croissance en Erlenmeyer en milieu non renouvelé

Dosage du glucose

Dilution d'une solution mère et filtration stérilisante de la solution diluée

Ajout de glucose dans le milieu, lancement de la croissance et suivi de la croissance en fonction du temps

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SECTION I.

Préparation de la solution de glucose

Les étapes à suivre

Préparation de la solution de glucose

• Peser 2,5 g de poudre glucose anhydre dans un bécher
• Dissoudre la poudre de glucose avec de l'eau distillé

• Transvaser la solution de glucose dans une fiole jaugée de 50 mL
• Ajuster au trait de jauge
• Stériliser la solution de glucose préparée par filtration à l'aide d'une seringue et d'un filtre

Organigramme de la manipulation

Cette préparation ne présente aucun danger.

Ajuster au trait de jauge

Nettoyer le bécher

Stériliser la solution

1

3

2

Afin de limiter les pertes en glucose, rincer immédiatement le bécher à l'aide de la pissette d'eau distillée directement au-dessus la fiole jaugée de 50 mL.

Prélever la solution de glucose avec la seringue.

Positionner le filtre au bout de la seringue sans toucher le filtre avec les doigts, ni la zone de la seringue qui est en contact avec la solution.

Utiliser une pipette stérile pour ajuster le volume de la solution de manière à positionner le bas du ménisque au niveau du trait de jauge de la fiole (placer le trait de jauge à hauteur des yeux).

SECTION II.

Croissance d'E. coli en Erlenmyer

Les étapes à suivre

Lancement de la croissance

• Ajouter 4 mL de la solution de glucose diluée et filtrée au 100mL de milieu LB stérile.
• Inoculer le milieu de culture avec 5 mL de pré-culture d'E. coli
• Prélever 2 mL de culture (t = 0)
• Incuber à 37°C sous légère agitation
• Réaliser des prélévements toutes les 30 min (2 mL)

Les étapes à suivre

Analyses des échantillons

• Mesurer l'atténuance des échantillons
• Centrifuger les échantillons
• Réaliser le dosage du glucose sur le surnageant

Organigramme de la manipulation

Contre blanc composé de milieu LB glucosé (premier alicot)

Diluer si la limite de linéarité est dépassé (0,7)

Conserver le prélèvement pour le dosage du glucose (partie 3)

Analyse a priori des risques

Analyse des points critiques

Vérifier la température de la plaque chauffante

Bien homogénéiser

Faire le prélèvement rapidement

Diluer si la limite de détection est dépassée

L'homogénéisation est primordiale durant toute la manipulation

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Le poste de travail

Les manipulations sont réalisées en zone d'aspesie.

Liste du matériel :

Propipette

Pipette stérile de 1 et de 5 mL

Préculture d'E. coli

100 mL de milieu LB stérile en Erlenmeyer

Solution de glucose stérile à ... g/L

Microcuves

Analyses des résultats du groupe

Ensemble des résultats de la classe

Les atténuances subissent une réduction logarithmique népérien

LINÉARISER LA PHASE EXPONENTIELLE DE CROISSANCE

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Courbe primaire de croissance

Les résultats de la classe sont compilés

Courbe secondaire de croissance

Les résultats de la classe sont compilés

Il est observé une augmentation de l'atténuance et donc de la biomasse.

Une très légère phase d'accélération est observée.

La phase de croissance exponentielle est linéarisée.

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Synthèse des résultats

La moyenne des atténuances à été réalisées et l'ensemble des essais à parmi de calculer un écart-type.

Sur Excel :

"=MOYENNE(...;...)"

"=ECART.MOYEN(...;...)

Plus les écart-types sont faibles, plus les résultats de tous les essais sont proches. Les barres d'erreur représentent les écart-types.

Représentation des écart-types

Moyenne des atténuances

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Synthèse des résultats

A l'aide de l'outil informatique, il est possible de déterminer le coefficient directeur de la courbe et donc :

Sur Excel :

"=PENTE(y;x)"

µexpo correspond à la pente

G = (ln 2) / µ expo

a = 0,0221 min^-1

µexpo = 0,0221 min^1

G = 31,44 minutes

SECTION III.

Dosage du glucose

Étapes à suivre

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• Étape 1: prélever 1mL du milieu LB glucosé à 2g/L et déverser dans un microtube.
• Étape 2: prélever 1mL du milieu LB glucosé ensemencé et déverser dans un microtube. Il s'agit de notre T0
• Étape 3: prélever 1 mL du milieu LB glucosé ensemencé et déverser dans un microtube après 120min. Il s'agit de notre T120
• Étape 4: Centrifuger les microtubes pendant quelques minutes

Étapes à suivre

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• Étape 5: Réaliser la manipulation avec le tableau ci-dessous
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• Étape 6: Faire les calculs de concentrations

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Calcul de concentration de masse

Équation aux grandeurs

Équation aux valeurs numériques

Équation aux unités

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Résultats

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En 120 min, les bactéries ont utilisé 0,54g/L de glucose.

Le glucose est la principale source de carbone que les bactéries peuvent métaboliser rapidement.

En 120 min, les bactéries ont utilisé 1,4g/L pour se développer.

Le glucose est la principale source de carbone que les bactéries peuvent métaboliser rapidement.

En 120 min, les bactéries ont utilisé 0,34g/L de glucose.

Le glucose est la principale source de carbone que les bactéries peuvent métaboliser rapidement.

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Conclusion

Comme nous pouvons le constater seulement 3 étudiants ont pu réaliser le dosage du glucose. Cette activité expérimentale était de taille conséquente et cela justifie que peu d'étudiant ont réussi à faire ce dosage.

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