Cápsula N°2

Problemas comunes observados en secuencias de ADN

Servicio de Secuenciación Sanger de ADN

Gioconda Peralta Loreto Carrasco

A veces cuando se envían muestras para procesar, el usuario no obtiene el resultado esperado. ¿Pero cómo saber que puede estar pasando?

A partir de los cromatogramas, podemos obtener indicios de cuales son los problemas.

En este video, te mostraremos los problemas más comunes que observamos en el servicio de secuenciación de ADN capilar Sanger.

En algunas muestras el cromatograma presenta un deslizamiento en la lectura, esto puede deberse a la presencia de una gran zona poliT.

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O por la presencia de una zona con microsatélites.

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En otras muestras a menudo observamos una doble señal al inicio de la secuencia y luego la señal se resuelve. Esto puede ocurrir por la presencia de dímeros de partidor y/o amplicones inespecíficos de menor tamaño que el producto de interés en la muestra.

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Otra manera de observar productos inespecíficos es la detección de señales de término de los fragmentos. En este cromatograma, se observan al menos dos fragmentos de tamaño inferior que amplificaron con el fragmento de interés.

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En esta señal observamos que la secuencia se interrumpe de forma brusca por lo que se obtiene una secuencia más corta que la esperada. Esto puede ocurrir cuando nos encontramos con una estructura secundaria que impide que la secuenciación continue.

En este ejemplo, al contrario de las señales anteriores la lectura comienza de manera normal, pero se vuelve doble a partir de cierto punto. Esto puede deberse a un PCR inespecífico, contaminación del ADN molde, clon múltiple y/o a que existe más de un sitio de unión del partidor.

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En este ejemplo, el cromatograma presenta una mini señal que está adelantada 1 nucleótido respecto a la señal principal (N-1). Esto puede deberse a un partidor mal purificado, parcialmente degradado o contaminado.

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Finalmente cuando la señal tiene baja intensidad, esto suele deberse a la presencia de impurezas en la muestra, como por ejemplo EDTA que interfiere con la reacción de secuenciación.

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Las impurezas que generalmente se observan en la razón 260:230 también puede observarse como una caída temprana y brusca de la señal.

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Esperamos que la información proporcionada les sea de utilidad.

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