Cápsula N°1

Consejos para obtener secuencias con buena calidad

Servicio de Secuenciación Sanger de ADN

Gioconda Peralta Loreto Carrasco

Para obtener buenas lecturas en la secuenciación Sanger es esencial que la muestra tenga una excelente calidad.En este video te daremos algunos consejos para obtener resultados óptimos.

La calidad del templado se ve afectado principalmente por impurezas que son co-purificadas junto al ADN, sucediendo incluso cuando se utilizan kits comerciales.

En el caso de productos de PCR antes de la secuenciación es fundamental purificarlos para eliminar el exceso de partidores, de nucleótidos no incorporados y sales, los cuales interfieren con la reacción de secuenciación.

Para evitar lecturas cortas o con bases indeterminadas (Ns), es importante:

Verificar en gel de agarosa la presencia de la banda deseada luego del proceso de purificación.

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Verificar en gel de agarosa que el producto sea de banda única, de lo contrario la secuencia tendrá ruido o será imposible de leer.

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Evaluar la calidad y concentración de las muestras por espectrofotometría.

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En la imagen se observa la curva ideal que uno esperaría para los ácidos nucleicos y de manera óptima índices 260:280 y 260:230 entre 1.8-2.0.

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Seleccionar adecuadamente el set de partidores a utilizar de acuerdo al gen de interés, esto evitará obtener más de dos lecturas.

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Optimizar el protocolo de PCR, de manera que sea una reacción eficiente y sin productos inespecíficos.

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Recomendamos en lo posible no purificar desde banda (gel) o utilizar agarosa con alto grado de pureza, esto se debe a que la agarosa interfiere en la reacción de secuenciación.

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Asimismo el buffer TE también interfiere en la reacción de secuenciación es por ello que se solicita que las muestras deben venir disueltas en agua.

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Verificar que no existe un sitio secundario de unión del partidor.

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Esperamos que estas recomendaciones les sean de utilidad.

Si tienes dudas contáctanos y trataremos de ayudarte.secuencias@bio.puc.cl

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