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Presentación dirigida al profesorado que quiera realizar la experiencia. de inclusión en resina. y otras técnicas.

Transcript

Técnicas empleadas para la creación de preparaciones

Uno de nuestros objetivos es poner a disposición del profesorado técnicas que puedan realizarse con materiales caseros. Aunque en la página principal se muestran algunos detalles hemos creído conveniente crear una presentación en la que se muestre un resumen de las técnicas utilizadas. A continuación mostraremos imágenes y explicaciones de las mismas junto con un enlace a un documento PDF que recoge, a modo de cuaderno de laboratorio, todas las técnicas y experiencias realizadas. Todos los materiales han sido adquiridos en comercios de la localidad, salvo el formol que lo compramos en Amazon.

Introducción

En los centros educativos es fácil encontrar microscopios, pero no es frecuente que existan microtomos de la calidad necesaria para realizar preparaciones, por eso se me ocurrió preparar una técnica similar a la que utilizan los geólogos para preparaciones de rocas. Para la realización de preparaciones de rocas, normalmente se siguen los siguientes pasos:

Introducción 2

Cortar una sección de la roca de aproximadamente 1 mm de espesor.Pulir una de las caras de dicha sección.Pegar la sección a un portaobjetos por la cara pulidaReducir la sección mediante lijado hasta reducirla a unas 50 micras de espesor.Pulir la cara para eliminar todas las marcas del lijado.

Todos sabemos lo dificil que es cortar un grano de pimienta, y lo fácil que resulta cuando está dentro de un salchichón, el problema es que para cortar tejidos biológicos habría que meter el "salchichón" dentro de la pimienta, es decir meter el medio de inclusión dentro del tejido. Para cortes a microscopía óptica se suele elegir la parafina como medio de inclusión, pero como queremos lijarlo necesitamos que el medio sea mucho más duro, así que hemos elegido resina de poliéster. La materia viva contiene mucha agua así que lo que haremos es sustituir el agua por resina, valiéndonos de una serie de pasos. Como se trata de una técnica de la que no existen referencias pensamos probar antes con un material perfectamente incluido en resina para ver si realmente podríamos obtener resultados aceptables.

Introducción 3

El material que teníamos de esas características eran estos bloques de piel de sapo incluída para microscopía electrónica.

En la pantalla siguiente podemos ver una comparativa del resultado obtenido con un corte de una micra de grueso realizado en condiciones óptimas .

La imagen de la derecha nos mues-tra las preparacio-nes obtenidas por corte y pulido del extremo del bloque, pegadas sobre un porta con resina epoxi.

Esta imagen fue obtenida de un corte de control (corte de un grosor aproximado a la micra) obtenido con un ultratomo LKB y teñido con azul de toluidina. Estos cortes se examinan con microscopio óptico para seleccionar la zona que posteriormente será cortada a 500 amstrongs de grosor para su examen a microscopía electrónica.

Si señalas entre las dos imágenes te mostrará las correspondencias.

Epidermis

Membrana basal

Cromatóforos

Melanóforos

Estos resultados nos mostraron que reduciendo la muestra por lijado a unas 50 micras podríamos obtener preparaciones que serían útiles a nivel de reconocimiento de formas celulares y disposición de las células en los tejidos estudiados. Evidentemente la afirmación anterior implica que la inclusión sea aceptable, pero nos indicaba que si lo conseguíamos la experiencia podría tener éxito, así que nos pusimos a la tarea.

Pulsando sobre la imagen podrá ampliarla y comprobar la presencia de las capas señaladas en la pantalla anterior. Evidentemente la técnica tiene muchísimas limitaciones pero entendemos que permite obtener imágenes muy superiores a las que pueden obtenerse utilizando los microtomos Ranvier que existen en algunos centros.

Protocolo de trabajo.

Para realizar la tarea deberemos proceder con los siguientes pasos:

Fijación de la muestra.Deshidratación.Inclusión en resina.Creación de bloques.Corte de la zona para estudio.Pulido de la cara inferior para eliminar todas las marcas del lijadoPegado al porta por la cara pulida.Lijado y pulido para la obtención de preparaciones gruesas (0.5 mm)Selección, lijado y pulido de preparaciones finas (0.05mm)Observación y obtención de imágenes.

Fijación

Los materiales biológicos se alteran rápidamente siendo necesario fijar las estructuras para que su aspecto sea lo más parecido posible a cómo eran cuando el organismo al que pertenecen estaba vivo. El medio fijador para tejidos vegetales más utilizado es el FAA (Formol, alcohol, acético). Podemos conseguir formol (en Amazon) y alcohol en cualquier droguería. El ácido acético puede ser más complicado, sobre todo si queremos pequeñas cantidades, así que el fijador que hemos empleado es el siguiente:

40% alcohol50% vinagre10% formol

40% alcohol50% vinagre (la proporción de acético en el vinagre es aproximadamente 5%, así que sustituyendo el agua por vinagre nuestro fijador tendrá 2.5% de acético, suficiente para nuestros objetivos.10% formol. Como la concentración del envase es del 40% conseguiremos el 4% adecuado.

Deshidratación

Ahora comienza el proceso de sustitución del agua por resina. A nuestro favor tenemos una ley física, que dice que si tenemos dos líquidos miscibles en contacto, estos difundirán hasta que las concentraciones de ambos sean iguales en toda la zona. Pero en contra tenemos dos cosas:

El agua y la resina no son miscibles.No existe ningún líquido que sea miscible con los dos.

¿ Qué vamos a hacer?

Deshidratación II

En primer lugar sustituiremos el agua por alcohol.

1. 20 min. Alcohol 50% 2. 20 min. Alcohol 96% 3. 20 min. Alcohol 96%

Ahora sustituiremos el alcohol por acetona, ya que ésta es miscible tanto con el alcohol como con la resina.

Inclusión

Para sustituir el alcohol por acetona y ésta por resina también daremos varios pasos.

30 min. Alcohol / Acetona (50/50)20 min. Acetona pura20 min. Acetona pura30 min. Resina / Acetona 30%30 min. Resina / Acetona 60%1h 50 min. Resina puraToda la noche (13 horas) . Resina pura

Preparación de bloques

Tras estos pasos habremos conseguido que el medio interno de nuestro tejido sea resina, así que ahora tendremos que polimerizarla. Hemos escogido resina de poliéster por varias razones:

Facilidad de obtención (cualquier droguería)Precio (menos de 10€ la lata de 1 kg.Posibilidad de polimerización por calor.

Nos conviene que la resina contenida en el interior de las células polimerice, así que si añadimos mucho catalizador, éste no llegará al interior de las células y la polimerización será rápida. Por tanto añadiremos muy poco catalizador y si es necesario polimerizaremos por calor en el interior de un horno a unos 50 o 60 ºC.

Obtención de las preparaciones.

Cuando los bloques hayan polimerizado por completo los desmoldamos, cortamos las zonas que nos interesen con una sierra de marquetería y procedemos como se indicó anteriormente:

Pulido de la cara inferior para eliminar todas las marcas del lijadoPegado al porta por la cara pulida.Lijado y pulido para la obtención de preparaciones gruesas (0.5 mm)Selección, lijado y pulido de preparaciones finas (0.05mm)Observación y obtención de imágenes.

En la pantalla siguiente podemos ver un a comparativa entre una buena preparación y una obtenida por nuestro método.

Comparación mesocarpio.

Obtenida del libro "El cultivo del olivo"Ver referencia:

"Corte" grueso 0.14 mm

De momento solo tenemos preparaciones gruesas, ya que hemos dado preferencia a la preparación de materiales para esta edición. El próximo año esperamos tener preparaciones finas que nos darán mayor calidad.

No olvidemos que con nuestro método cuando decidimos proseguir con el lijado podemos destruir la preparación, por lo que debemos realizar previamente todas las fotografías que estimemos interesantes.

Otras preparaciones.

Además de la técnica descrita hemos realizado otras que se corresponden con las imágenes siguientes:

http://www.olivaryescuela.tk/divulgacion/Rincon/rincon_2018.htm

http://www.olivaryescuela.tk/divulgacion/Rincon/rincon_2020.htm

Pelos estrellados Estomas

Epicarpio Endocarpio

Pulsando sobre las direcciones podrá ver más detalles respecto a su realización.

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Espero que te sirva.

INicio

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