Cycles PCR

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Température : 15°C Brins initiaux : séquence à amplifier

Dénaturation initiale: Le chauffage doit permettre de dénaturer* les molécules d'ADN. Suivant les fournisseurs : T°95°C ou 98°C 5 minutes ou 5 secondes *Dénaturation : rupture des liaisons faibles (liaisons hydrogènes) liants les 2 brins de la molécule d’ADN

Dénaturation de la matrice d’ADN Le chauffage sépare les brins d'ADN, étape indispensable pour permettre la fixation des amorces et la polymérisation. Température : 98°C ou 95°C (suivant les fournisseurs)/5 secondes

Hybridation : Les amorces se fixent sur les régions correspondantes. La séquence de la région à amplifier doit donc être connue. Ces fixations doivent se faire à température plus basse. Température : 55°C / 5 secondes

Élongation L'ADN polymérase (Taq polymérase) effectue la réplication : il s'agit de l'élongation. La température idéale de l'enzyme est de 72°C. . Cette phase doit se faire en présence de nucléotides libres.

• Tous les brins matrices ne sont pas forcément liés par un complexe amorce/polymérase lors de la phase d’hybridation. La probabilité d’amorçage peut être influencée par la température, la longueur et la séquence de l’amorce, sa composition en nucléotides naturels ou modifiés, sa concentration dans la solution, la composition ionique de cette dernière, l’auto-hybridation entre les amorces ou la compétition possible d’ADN non cible (par exemple un pseudo-gène).

• Toutes les synthèses ne sont pas forcément complètes, notamment si la phase d’élongation est trop courte. Un brin incomplet à son extrémité 3’ ne peut pas servir de matrice car l’amorce complémentaire ne peut pas se lier à lui.